MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Резюме

Белковые комплексы катализируют ключевые клеточные функции. Подробные функциональные и структурные характеристики многих важных комплексов требует рекомбинантного производства. MultiBac является бакуловирус / клетка насекомого разработана специально для выражения эукариотических белков и их комплексов. MultiBac был реализован как открытая платформа доступа, и стандартных оперативных процедур разработаны для максимального использования ее полезности.

Аннотация

Протеомики исследования показали впечатляющие сложности эукариотических протеомов в беспрецедентных деталях. Теперь это общепринятое понятие, что белков в клетках основном существуют не как изолированные сущности, но проявляют свою биологическую активность в сотрудничестве со многими другими белками, у человека десять и более, образуя сборочных линий в клетке для большинства, если не всех жизненно важных функций. ^{1 , 2} Знание функции и архитектура этих мультибелковых сборки требует их положение высшего качества и в достаточном количестве для детального анализа. Недостатком многих белковых комплексов в клетках, в частности у эукариот, запрещает их извлечения из природных источников, и требует рекомбинантной продукции. Вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs) оказалась особенно полезной для производства белков эукариот, деятельность которых зачастую зависит от посттрансляционное обработки, которые обычно используются другие системы экспрессии часто можетне поддерживают. ³ BEVs использовать рекомбинантный бакуловирус, в который ген был вставлен инфицировать насекомое клеточных культур, в свою очередь продуцировать белок выбора. MultiBac является BEVs, которая была разработана специально для производства эукариотических белковых комплексов, которые содержат множество субъединиц. ⁴ жизненно важным условием для эффективного производства белков и их комплексов являются надежными протоколов для всех операций, связанных выражение эксперимент, который идеально может быть реализован как стандартные операционные процедуры (СОП) и последуют и неспециалисту пользователей сравнительно легко. MultiBac платформы на Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) использует СОП для всех операций, связанных мультибелковый сложный эксперимент выражения, начиная с введения генов в геноме инженерных бакуловирусные оптимизирован для гетерологичными свойствами производства белка мелким анализа белка образцов, полученных. ^5-8 платформыустановлен в открытом доступе в режиме EMBL Гренобля и поддержал многие ученые из академических и промышленных ускорить белковый комплекс исследовательских проектов.

Введение

Биологическая активность контролируется сборки белков и других биомолекул, которые действуют совместно, чтобы катализировать клеточных функций. Известные примеры включают механизм, который расшифровывает наследственной информации, содержащейся в ДНК в РНК. У людей, более 100 белков собрались вместе в определенной и регулируемым процессом, чтобы расшифровать гены, образуя крупные комплексы мультибелковых с 10 и более субъединиц РНК-полимеразы в том числе II и общих факторов транскрипции, таких как TFIID, TFIIH и другие. ⁹ Другие примеры рибосомы, состоящие из многих белков и РНК, который катализирует синтез белка, или ядерного комплекса пор, который отвечает за челночные биомолекул посредством ядерной оболочки у эукариот. Подробные архитектурные и биохимические вскрытия практически всех многокомпонентных машин в клетке важно понять их функции. Выяснение структуры прокариотических и eukaryotic рибосомы, например, составили отличительной чертой событий получая беспрецедентное понимание, как эти машины макромолекулярными выполнять свои определенными функциями в клетке. ^10,11

Рибосомы могут быть получены достаточные количества и качества для детального исследования путем очистки эндогенного материала из культивируемых клеток, в связи с тем, что до 30% от клеточной массы состоит из рибосом. РНК-полимераза II уже менее обильными на порядки, и многие тысячи литров дрожжевой культуры должны были быть обработаны для получения детальной атомной связи с этим необходимо, чтобы комплекс центральной транскрипции. ¹² Подавляющее большинство других важных комплексов, однако в настоящее значительно ниже суммы в нативных клетках, и таким образом не может быть очищена от родных адекватно исходный материал. Оказывать такие комплексы доступными для детального структурного и функционального анализа требует гетерологичными производства с помощью рекомбинантных TEchniques.

Рекомбинантного белка оказала большое влияние на жизни научных исследований. Многие белки были получены рекомбинантным, а их структура и функция расчлененный с высоким разрешением. Структурной геномики программ воспользовались выяснение геномы многих организмов для решения репертуаром генов произведения целых организмов в высокой пропускной способности (HT) режиме. Тысячи белковых структур таким образом, были определены. На сегодняшний день наиболее плодотворно использовать системы для производства рекомбинантных белков была E. палочка, и многие системы экспрессии были разработаны и уточнены в течение многих лет для гетерологичной производства в этой хоста. Плазмиды, несущие множество функциональных чтобы белка в E. палочка заполнить все каталоги коммерческих провайдеров.

Тем не менее, E. палочка имеет определенные ограничения, которые делают его непригодным для производства многих эукариотических белков и в рсуставной белковые комплексы со многими субъединиц. Поэтому белка в эукариотических хозяев становится все более предпочтительным методом в последние годы. Особенно хорошо подходит система для получения эукариотических белков вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs), которая опирается на рекомбинантного бакуловируса проведение гетерологичных генов инфицировать насекомое клеточных культур выращивали в лаборатории. Система MultiBac является более недавно разработанных BEVs который особенно приспособлены для производства эукариотических белковые комплексы со многими субъединиц (рис. 1). MultiBac был впервые представлен в 2004 году. ⁺¹³ С момента своего появления, MultiBac была постоянно совершенствуется и усовершенствованной для упрощения обработки, улучшения качества белка-мишени и в целом делает систему доступной для неспециалиста пользователей путем разработки эффективных стандартных операционных процедур (СОП). ⁴ MultiBac была реализована во многих лабораториях во всем мире, в соотademia и промышленности. На EMBL в Гренобле, транснациональных программах доступа были введены в действие Европейской комиссии обеспечить подготовку специалистов в MultiBac платформы для ученых, которые хотели бы использовать эту систему производства для продвижения своих исследований. Структура и функции многих белковых комплексов, которые были до сих пор не доступны было выяснено использованием образцов, полученных с MultiBac. ⁴ В дальнейшем основные этапы производства MultiBac сведены в протоколы, как в эксплуатацию в MultiBac объекта в EMBL Гренобле.

протокол

1. Тандем Recombineering (TR) для создания конструкций Multigene Выражение

1. Планирование совместной экспрессии стратегии. Проектный подход для вставки вашего интерес генов в доноры и акцепторы. Потенциальные физиологические подмодулей вашего комплекса должны быть сгруппированы по конкретным акцепторы и доноры. Используйте Умножение модуль, состоящий из самонаведения эндонуклеазы (HE) - BstXI Объедините пары кассет экспрессии на индивидуальных доноров и акцепторов плазмид ^7,8 Создать всех соответствующих конструкций в кремнии и утвердить стратегию тщательно, прежде чем приступить к экспериментальной работе.. Например, представляющих интерес генов должен быть проверен, чтобы не содержать ОН или других сайтов рестрикции и наличие правильных открытые рамки считывания (ОРС), должны быть проверены. Рассмотрим заказе синтетические гены насекомого оптимизирован для использования кодонов мРНК клетки и вторичные структуры в целях повышения уровня белка, а также удаление любых Exiжало высокопроизводительных станций от генов интерес. Рассмотреть вопрос о размещении очистки тегов, основанных на литературных данных о гибком или подвергается N-или С-концы ваших белков выбора. Рассмотрим применение полипротеине стратегии, которые направлены на производство нескольких субъединиц белка в Вашей сложной, если относительные количества отдельных белков необходимо контролировать из-за стехиометрии вопросы в комплексе. ⁴ подготовить подробные "как-бы" документ (электронная книга лаборатории рекомендуется), содержащий все прогнозируемые экспериментальных этапов проекта, ведущих к полной конструкции мультигенное (ов). Создать электронные файлы CRE-LoxP плавленого плазмид например, путем использования CRE-ACEMBLER программное обеспечение, которое можно скачать на домашней странице группы Бергер ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ).
2. Вставьте интерес генов в отдельных доноров иАкцепторы с помощью ферментов рестрикции и лигазы, или, наоборот, с помощью независимых методов перевязки после опубликованных протоколов. ^5,6,14 Если у вас есть доступ к наливных рабочей станции и если вы планируете большое количество конструкций, которые будут созданы ( например, для комбинаторной подходы) рассмотреть возможность использования робототехники скрипты разрабатываются и осуществляются Бергер группы (рис. 2). ^14,15 Если наливных рабочая станция не доступна, ручное управление использованием микропланшет позволяет гену вставки в HT, как мода.
3. Ограничений, связанных с необходимостью контроля стехиометрии выразил субъединиц может материализоваться. В случае стехиометрически несбалансированные уровни экспрессии отдельных субъединиц белка комплекса, рассмотреть вопрос о применении полипротеина стратегии соединить несколько субъединиц ваш сложной и специфической протеазы (например вируса гравировки табака NIA протеаза) в один большой ORF, разнесенных на секpecific протеолитических сайтов. ^4,8 Рассмотрим коэкспрессирующей одного или нескольких полипротеины с одной кассеты экспрессии если у вас есть очень большой комплекс со многими подразделениями и широко диапазоне молекулярных масс отдельных субъединиц. Рассмотрим совместной экспрессии нескольких генов, кодирующих тот же белок в полипротеина или несколько одинаковых экспрессионные кассеты, если это белок характеризуется низким выходом продукции. ^4,13
4. Проверить все донора и акцептора конструкции клонировали ограничение отображения (необязательно в высокой пропускной способности) и последовательности. Перейдите на предохранитель донор-акцепторного комбинаций пу-LoxP рекомбинации для генерации мультигенные выражения конструкции выбора. Подтвердить очищенной акцепторного доноры плазмид слияния ограничением отображения, используйте электронные последовательности создан CRE-ACEMBLER или аналогичных программ в качестве эталона.
5. Хранить очищенные и утверждены Доноры, акцепторы и доноры-акцепторных слияния при -20 ° С или -80 ° С. Архив PLasmids и их последовательности (Microsoft Excel, Filemaker и др.) тщательно для дальнейшего использования.

2. Композитный Multigene Бакуловируса генерации, усиления и хранения

1. Интеграция векторов мультигенные передачи MultiBac бакуловирусные генома, превращаясь в DH10 клетки, несущие вирусного генома и функциональности необходимой для Tn7 транспозиции. Следует отметить, что Multibac бакуловирусного генома могут быть предварительно загружены с особым интерес генов (YFP маркер, сопровождающих и т.д.) в своем месте LoxP (инженерии в геном дистальнее Tn7 места прикрепления) путем Cre в естественных условиях реакции предшествующих Tn7 интеграции. После ¹³ Tn7 транспозиции, клетки с композитными бакуловирусе содержащие гены интерес выбираются синий / белый скрининг (успешном Tn7 транспозиции приводит к потере α-комплементацией β-галактозидазы, поэтому колонии с правильными Tn7 транспозиции остаются белыми на селективныегр чашках, содержащих X-гал) и геном получают путем щелочного лизиса и этанол / изопропанол осадков. ^5,6
2. Трансфекции и начальное производство вируса. Место 6-и культуре ткани пластины в стерильную капотом. Из лог-фазе Sf21 культуры клеток насекомых, семена из аликвоты клеток в лунках и трансфекции добавлением очищенной бакуловирусного генома и реагента для трансфекции смешаны в культуральную среду, как описано. ⁶ урожая начальный вирус после 48-60 часов, удаляя среды ( высокое качество, низкий титр вируса V _0, обычно 3 мл на лунку). Дополнение свежей среды, и испытание для продукции белка (и, при YFP маркер присутствует, по флуоресценции) после дополнительных 2-3 дней. ^6,7
3. Усиление вируса, низкий МВД режима. Используйте V ₀ вирусом заразить 25-50 мл клеток в логарифмической фазе (плотность клеток <1x10 ⁶ клеток на мл) в небольшом (100-250 мл) колбы Эрленмейера шейкере взволнованнымОрбитальные шейкеры на платформе (рис. 3). Граф клеток и разделить каждые 24 часа, пока клетки остановить удвоением (пролиферация ареста). Последующие низкой MOI (множественностью заражения т.е. количество вирусных частиц на клетку) схеме: Клетки должны удвоить (по крайней мере) один раз (MOI <1), в противном случае повторить эксперимент с меньшим объемом V ₀ добавлены. Обычно 3 мл V ₀ используются для инфицирования 25 мл Sf21 клетках насекомых с плотностью 0.5x10 ⁶ клеток / мл. Это необходимо для предотвращения вредного чрезмерного усиления и автоматического удаления вирусов, которые могут привести к потере гетерологичных генов, представляющих интерес. Урожай V ₁ вирус (25-50 мл) после 48-60 часов по гранулированию клетки и удаления носителя, содержащего вирус. Дополнение свежей средой и тест на YFP и белка, удалив 1x10 ^{6 клеток} каждые 12 или 24 часа, гранулирование и проверки производства белка и маркерного белка (YFP) сигнала. ^6, Amplify вируса (вV ₂₎ далее, если большие объемы выражения направлены на, заражая до 400 мл клетки в 2 л шейкер колбы с V ₁ вирус уважении выше низкого МВД режима (клетки должны удвоиться по крайней мере раз после заражения V _1). Строго Производственное испытание белка и сигнал маркерного белка в процессе амплификации, чтобы избежать накопления дефектных вирусов больше не содержащий ваши гены интереса. ^5-7 Использование клеточных осадков накапливается на каждом шагу уже амплификации для создания протоколов для очистки белкового комплекса выразили интерес.
4. ВПс хранения продукции вируса. Мы рекомендуем, чтобы хранить V ₂ вирус как производство вируса с помощью ВПс (B aculovirus-я nfected я nsect с локтя), способ для предотвращения модификации (например, потеря интересующего гена) рекомбинантного вируса и сохранить высокий уровень экспрессии уровеньS ¹⁶ пеллетах инфицированных клеток через 24 часа после ареста распространения наблюдается -. на данном этапе клетки содержат полных вирусных частиц как раз перед они будут освобождены (почкованием) в средствах массовой информации. Удалить информации и замораживание аликвоты клеточного осадка в жидком азоте и хранить до бесконечности. ^7,16

3. Производство белков и последующей обработки

1. Заражение большой (R) культур и мониторинга YFP. Используйте V _1, V ₂ или замороженные ВПс аликвотам заразить большее клеточных культур для производственного цикла (обычно 400 мл в 2 колбы L). Придерживайтесь режима низкого МВД (отрегулировать громкость вирус используется для инфекции, такой, что инфицированные культуры по меньшей мере вдвое раз). Увеличить объемы инфицированной культуре при необходимости путем умножения количества колб. Если YFP маркерного белка присутствует, снять через определенные промежутки времени 1x10 ⁶ клеток, гранул и лизируют клетки и контролировать эволюцию YFP сигнала, пока не будет достигнуто плато INDicating максимальной рекомбинантного белка. YFP уровни могут быть измерены в стандартных 96-луночных планшет-ридере способна записывать сигналы флуоресценции (например Tecan SPECTRAFluor). Урожай клетки на этой стадии. Магазин клеточные осадки при температуре -20 ° С (кратковременно) или -80 ° C (долгосрочные).
2. Лизис клеток и фракционирования. Клетки лизируют вашим любимым методом выбора, с учетом требований вашего белка (замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, французская пресса, др.). ^5-7 фракционирования цитозоле и ядрах и тест на наличие вашего белков, представляющих интерес. Разработка очистки протоколов на основе результатов для упрощения очистки белков. Рассмотрим применение процедуры замачивания для извлечения белка из ядерной фракции при высокой KCl условий, если ваш белки находятся в ядре. ^7,18
3. Белки очистки (микро-масштабе, крупномасштабное). Следует отметить, что часто небольших объемов (10 или 25 мл) клеточной культуры суfficient для получения осадка клеток для очистки значительное количество ваших белков, представляющих интерес в связи с обычно высокий или очень высокий уровень производства чужеродных протеинов в бакуловирус / клетка насекомого систем (часто 10-100 мг белка на литр культуры и более). В сочетании с микро-очистки (луночные планшеты, микроострийных методов, GE Healthcare ÄKTAmicro системы, другие) можно получить биохимических и данные о деятельности и часто также достаточным количеством желаемого белка и комплексы Nanoliter масштабе высокой пропускной кристаллизации (НТХ ). Рассмотрим с использованием металлических аффинной очистки (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA хелатирующий металл смолы) и олиго-гистидин (6-10 остатков) тег на открытых субъединиц ваш белковый комплекс для облегчения очистки, в сочетании с ионным обменом и эксклюзионной хроматографии в небольших Объемы используя, например, ÄKTAmicro или аналогичную машину очистки небольших объемов (рис. 4 ). Другие аффинной очистки шаги и ионного обмена (IEX) шагов в дополнение к аффинной очистки с олиго-гистидин теги и другие теги (выбрать из GST, MBP, СВР и др.) могут и должны рассматриваться в соответствии с биохимическим свойствам белков интересов и индивидуальных предпочтений. Рассмотрим пометки более одной субъединицы с аффинные метки для повышения эффективности очистки. Сконцентрируйте свое очищенных белковых комплексов и созданию хранения протоколов, таких как замораживание с или без глицерина. Разработка критериев контроля качества, которые могут применяться стандартно (анализов активности, биохимических и биофизических тестов) для оценки партии к партии изменение ваших очищенных белков.

Результаты

Сильные совместной экспрессии гетерологичных белков достигается MultiBac система показана на рисунке 1d (зонды принято 48 часа после заражения суспензионной культуре клетки). Сверхэкспрессированную белковых полос явно видны во всем клеточном экстракте (SNP) и очищенного лизата (SN). ...

Обсуждение

Видео оснастку выстрелов на Фиг.2 и 3 иллюстрируют весь процесс от роботизированной поколения из кДНК мультигенное экспрессирующие конструкции, вплоть до заражения насекомыми культур клеток для продукции белка. Новые реагенты (плазмиды и вирусы) и надежные протоколы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103