Использование компьютерной томографии высокого разрешения для визуализации трехмерной структуры и функции сосудистой завод

Резюме

Высокое разрешение рентгеновской компьютерной томографии (КТВР) является неразрушающим методом диагностики визуализации, которые могут быть использованы для изучения структуры и функции сосудистой завода в 3D. Мы показываем, как КТВР облегчает изучение ксилемы сети в широком диапазоне тканей растений и видов.

Аннотация

Высокое разрешение рентгеновской компьютерной томографии (КТВР) является неразрушающим методом диагностики визуализации с субмикронной разрешающей способности, которая сейчас используется для оценки структуры и функции растений сети ксилемы в трех измерениях (3D) (например, Brodersen и др. . 2010; 2011; 2012A, б). КТВР визуализации основана на тех же принципах, медицинских CT системы, но высокая интенсивность синхротронного источника рентгеновского излучения приводит к более высоким пространственным разрешением и снижение времени захвата изображений. Здесь мы покажем, в деталях, как синхротронное на основе КТВР (выполняется на Advanced Light Source-LBNL Беркли, Калифорния, США) в сочетании с Avizo программного обеспечения (VSG Inc, Берлингтон, штат Массачусетс, США) в настоящее время используется для изучения растений в ксилемы подакцизным ткани и живых растений. Этот новый инструмент визуализации позволяет пользователям выйти за рамки традиционного статические, 2D световой или электронной микроскопии и изучения образцов с использованием виртуальных последовательных секций в любой плоскости. Бесконечное количество кусочков в любой ориентации сбыть сделан на том же образце, особенность, которая является физически невозможным использование традиционных методов микроскопии.

Результаты показывают, что КТВР может быть применен как для травянистых и древесных видов растений, а также ряд органов растений (например, листья, черешки, стебли, стволы, корни). Цифры, представленные здесь поможет продемонстрировать, как ряд представителей анатомия сосудистых растений и типа подробно извлечены из КТВР данных, включая сканирование на побережье красного дерева (Sequoia sempervirens), грецкий орех (Juglans SPP.), Дуб (Quercus SPP.), Клен ( Acer SPP). саженцев деревьев на подсолнечник (Helianthus Annuus), виноград (Vitis SPP.), и папоротники (Pteridium aquilinum и Woodwardia Fimbriata). Вырезанные и сушат образцы древесных пород являются самыми легкими для сканирования и обычно дает лучшее изображение. Тем не менее, в последнее время улучшения (т.е. более быстрое сканирование и образцы стабилизации) сделали это ПОССible, чтобы использовать эту технику визуализации на зеленой ткани (например, черешков) и в живых растениях. В отдельных случаях некоторые усадки гидратированных зеленых тканях растений может привести к размытости изображения и методы, чтобы избежать этих проблем описаны. Эти последние достижения с КТВР обеспечить перспективное-новому взглянуть на заводе функцию сосудов.

Введение

Вода переносится из корней растения с листьями в сосудистой ткани, которая называется ксилемы - сеть взаимосвязанных трубопроводов, волокон и жизни, метаболически активных клеток. Транспортная функция завода ксилемы должна поддерживаться на поставку питательных веществ и воды на листья для фотосинтеза, роста, и в конечном счете выживание. Водный транспорт в ксилемы каналов может быть нарушен, когда ксилемы сеть будет скомпрометирована патогенными организмами. В ответ на такие растения инфекции часто производят гели, десен и tyloses в качестве средства для изоляции возбудителя распространения (например, McElrone и др., 2008; 2010). Засуха стресс также может ограничить водного транспорта в ксилемы. Как растения теряют воду во время продолжительной засухи, напряженность строит в ксилемы сок. Вода под напряжением является метастабильной (т.е. на определенный порог напряжения становится достаточно большим, чтобы кавитации воды столбцов, содержащихся в древесине трубопроводов). После кавитации, газовый пузырь (эмболия) может сформировать и наполнить кондUIT, эффективно блокируя движение воды (Тайри и Sperry, 1989), явление, аналогичное декомпрессионной болезни (например, "изгибы") в ныряльщики.

Несмотря на важность ксилемы водного транспорта для оптимального функционирования завода как показали огромный объем исторической и современной литературы на эту тему (Тайри & Zimmermann, 2002;. Холбрук и др., 2005), есть еще аспекты ксилемы сетей, которые остаются неизвестными . Несколько исследовательских групп в последнее время стали использовать высокое разрешение рентгеновской компьютерной томографии микро-(КТВР), чтобы оценить тонкости анатомии древесины и сосудистой ткани (например, Майо и др.; 2010, 2008; Маннес и др., 2010;. Brodersen и др. 2010 год. , 2011, 2012A, б; Maeda и Miyake, 2009; степь и др., 2004).. КТВР является неразрушающим методом, используемым для визуализации функций внутри твердых предметов и получения цифровой информации о своих 3-D структурные свойства. КТВРотличается от обычного медицинского CAT-сканирование в своей способности решать детали, как маленький микронного размера, даже для объектов высокой плотности. Последние достижения в области технологий синхротронного КТВР улучшить разрешение и отношение сигнал-шум достаточно, чтобы растение судно сетей и intervessel соединения могут быть визуализированы, присвоенный 3D-координаты, и экспортируется для гидравлического моделирования модель. Brodersen и соавт. (2011) недавно выдвинул эту технику, объединяя 3D реконструкции порожденных синхротронного КТВР с моделью Fortran, которое автоматически извлекает данные из ксилемы сети на гораздо более высокое разрешение, чем это было когда-либо возможно с традиционными методами анатомической (т.е. последовательный секционирования с микротома и захвата изображений с световой микроскопии, например, Zimmermann, 1971). Эта работа была также использована для оптимизации гидравлических моделей ксилемы системы и определены уникальные характеристики транспорта (т. е. обратный поток в некоторых веssels в периоды пиковой транспирация) (Lee и соавт., в обзоре).

Синхротронного КТВР теперь могут быть использованы для визуализации ксилемы функциональность, склонность к кавитации, и способность растений к эмболизации ремонт трубопроводов. Неспособность восстановить поток в эмболизированной каналов снижает гидравлическую мощность, пределы фотосинтеза, и приводит к гибели растений в крайних случаях (McDowell и соавт. 2008). Растения могут справиться с эмболией, отвлекая воды вокруг завалов через ямы подключении соседними функциональными трубопроводов, и ростом новых ксилемы, чтобы заменить потерянные гидравлической мощности. Некоторые растения обладают способностью восстанавливать разрывы в воде столбцов, но детали этого процесса в древесине под напряжением остаются неясными в течение десятилетий. Brodersen и соавт. (2010) недавно визуализировать и количественно процесс заправки в живой виноградной лозы использованием КТВР. Успешное судна заправки зависела от притока воды из живых клеток, окружающих XYLет каналы, где отдельные капли воды расширен с течением времени, заполненные сосуды, и вынужден роспуска захваченного газа. Потенциала различных растений для ремонта скомпрометирована ксилемы судов и механизмов, контролирующих эти ремонты в настоящее время ведется расследование.

Описание объекта ALS Beamline 8.3.2

Наша работа на сегодняшний день было проведено на жестком рентгеновском Micro-томографии Beamline 8.3.2 на Advanced Light Source в Lawrence Berkeley National Lab (Беркли штат Калифорния, США). Завод Образцы помещают в свинцовой подкладкой клетка находится в 20 м от источника рентгеновского излучения, генерируемого с помощью 6 Tesla сверхпроводящих дипольных магнитов изгиб в Advanced Light Source электронного накопителя, работающего на критическую энергию в 11,5 кэВ. Схема конечной станции показано на рисунке 1. X-лучи попадают в клетку с пучком размером 40х ~ 4,6 мм и проходит через образец, который установлен на сцене моторизованные вращающиеся.передаваемые рентгеновские лучи падают на кристалл сцинтиллятора (двух материалов, обычно используемых LuAG или CdWO _4), которые превращают рентгеновские лучи видимого света, который передается через линзы на ПЗС для коллекции изображений. Камеры, сцинтиллятор и оптики, содержащиеся в светонепроницаемый ящик, который находится на рельсах, которая позволяет образца к сцинтиллятор расстояния должны быть оптимизированы для фазы изображения контраста.

Все образцы установлены на 10 см, диаметр поворотного этапа, который в свою очередь крепится на горизонтальных и вертикальных перевод этапы позиционирования образца. Образец живого растения, с корневая система установлена ​​в пользовательских построен завод держателя горшка и листвы, содержащиеся в акриловую трубку, можно увидеть на рисунке 2. Типичное время экспозиции может варьироваться от 0.1-1 с использованием 10-18 кэВ, длительность сканирования будет колебаться от 5-40 минут в зависимости от настроек, оптимизированных для конкретного образца. Для высоких образцов (типичный сетей завода ксилемы), данные сканирования может бытькафельные, повторяя измерения с образцом на разных высотах, которая контролируется автоматически, позволяя бесшовных серийных срезов по максимальной высоте образца ~ 10 см. Максимальная ширина образца при визуализации в 4,5 мкм, разрешение ~ 1 см для образцов, которые являются почти идеальным в вертикальной ориентации. Данные поколения и завершения обработки с использованием протокола приведены ниже. Из-за разницы в рентгеновских затухание между воздухом и водой, отличную контрастность изображения могут быть получены в растения без использования контрастных решения типичных медицинских систем КТ. Заполненные воздухом просвет сосуда легко отличить от окружающих заполненные водой ткани в гидратированных растений.

протокол

Протокол подробно описанные ниже, были написаны специально для работы в Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Адаптации могут быть необходимы для работы на других объектах синхротрона. Правильное безопасности и радиационной подготовка необходима для использования этих объектов.

1. Подготовка проб для живых растений

1. Выращивать растения в горшках ~ 10 см в диаметре, и убедитесь, что главный стебель (или часть растения, которые будут проверяться) такой, как в центре, как это возможно, и ориентированы вертикально в кастрюлю. Физические размеры прибора КТВР клетку в пределах Advanced Источник света растения живут до ~ 1 м в высоту. Как следствие, изображение живых растений лучше всего проводить на саженцы / Саженцы, выращенные в небольших горшках. В зависимости от эксперимента, различных типов почв могут быть использованы для контроля влажности почвы (например, в экспериментах засухи), а для некоторых растений с гибкими побегами (например, виноградной лозы) больше побегов можно осторожно вттрахнуться в акриловую трубку описано ниже (см. рисунки 1 и 2).
2. Установить живые растения в горшках на заказ жестким держателем алюминиевую кастрюлю. Высота верхней пластине можно регулировать, чтобы приспособить диапазон горшок высот. В верхней части пластины предназначена для выравнивания верхней поверхности почвы, и растения выступает из центра две части пластины. Целью банка является держателем для обеспечения стебель растения прочно удерживается на месте, чтобы минимизировать вибрацию или образец движения. Минимизация образца движения во время сканирования является существенным.
3. Как только установлена ​​в держателе, измерить потенциал стволовых воды или листьев транспирация помощью давления Шоландер камерного стиля или клип на листе порометров, соответственно, для определения физиологического состояния растений до начала сканирования.
4. Поместите тонкостенных цилиндров акриловые над заводом и на верхней части держателя алюминиевого завода и закрепить ее на месте с помощью глины шпатлевки, чтобы стабилизироватьобразца (рис. 2). Любые вибрации или движения верхних листьев будут передаваться вниз по стеблю и вызывает растительной ткани в области сканирования двигаться, в конечном итоге приводит к искажению изображения. Цилиндр используется для хранения листве растений и предотвращает листья растений от трения по отношению к другим единиц оборудования в клетке, что может привести к вибрации во время сканирования. Дополнительная упаковка пластиковые, бумажные полотенца, и ленты должны быть использованы для дальнейшей минимизации вибрации и движения частей растений (см. проблемы, связанные с образцом движения в рис. 4). Чтобы уменьшить ее рентгеновского поглощения (которое может уменьшить качество изображения при заданном времени экспозиции), содержащий цилиндр должен иметь тонкие стенки, как возможна при условии сохранения достаточной жесткостью, чтобы выполнять свою функцию.
5. Прикрепите держатель пользовательский банк на сцене подшипник воздуха и заблокировать его (винт) на место между источником рентгеновского излучения и датчик изображения камеры и оборудование. Positiна стебле вертикально по центру и на магнитном основании для обеспечения патрон образца остается в поле зрения во время вращения.

2. Подготовка проб для свежих, подакцизных ткани растений

1. Свежий растительный материал, как правило, стеблей или черешков, могут быть проверены после немедленного удаления из живых растений. Если цель эксперимента заключается в визуализации совокупности ксилемы сеть, вода в сосудах должны быть эвакуированы и заменить воздух. Чтобы сделать это, установите образца в барокамере стиле Шоландер и нажмите сжатым воздухом или азотом через образец при низком давлении (<0,05 МПа) в течение примерно 5 мин. Виды будет отличаться время, необходимое для эвакуации судна сети. Если целью является оценка степени эмболии образование в свежей растительной ткани, то акциз образцов растений с использованием свежей лезвие бритвы и делают разрезы под водой.
2. Оберните образца в слое Parafilm к пр.события высыхании во время сканирования.
3. Установить образец в детализации патрон крепится к металлической пластине, которая ввинчивается в стадии подшипник воздуха. Центр и Восток образца вертикально, как описано выше, чтобы обеспечить образца остается в поле зрения.

3. Подготовка проб для сушеных тканей Woody

1. Для оптимальной визуализации образца ткани и контрастность изображения, необходимо, чтобы медленно обезвоживает весь образец ткани древесных. Вырезать образцы примерно 6 см в длину. Выберите образцы, которые являются как можно более прямо в целевые проверки региона и имеют диаметр ≤ 1 см.
2. Поместите образец древесной ткани в сушильном шкафу при низкой температуре медленно высушить образец, не вызывая никаких трещин или расщепление тканей. Этот процесс, скорее всего, отличаются между видами и тканей. Для древесных стволов, 12 час в духовку на 40 ° C, как правило, достаточно для обеспечения отличной контрастностью, не вызывая значительного чаnges в физическом строении ствола (см. проблемы с быстрой сушкой показано на рисунке 3).
3. В некоторых ситуациях желательно иметь доверительного маркера в образце так, что последующее вскрытие и визуализации с помощью сканирующего электронного микроскопа могут быть ориентированы на конкретные точки в КТВР изображения. Для этого, закрепите металлическими или стеклянными шариками или проволокой к внешней стороне стебля использованием Parafilm. Другой метод заключается в использовании силиконовых смол (например, RTV-141, Bluestar Силиконы, East Brunswick, NJ), которые могут быть введены в одной трубопровод ксилемы (см. примеры в Brodersen и др., 2010). После затвердевания силиконовой смолы отчетливо видна в образце и легко отличить от других заполненных воздухом суда. Используйте этот маркер для точного определения конкретных областей образца.
4. Установить образец в патрон и центр, как описано выше.

4. Подготовка проб для листьев Tissuе для двухмерных (2D) Радиограммы

1. Для визуализации судно содержание в листьях в близком к реальному времени, листья могут быть проверены, чтобы произвести 2D радиограмму, похожие на стоматологические рентгеновские. Установите листа между двумя листами тонкого пластика акрил, и закрепите края с клипами. Затем приложите установлен образец пост-держатель системе и положение оптической макета рядом с системой визуализации и источником рентгеновского излучения.

5. Сканирование образца в 8.3.2 Hutch

1. Решите увеличения, что будет работать лучше всего для вашего приложения. ALS Beamline 8.3.2 имеет возможность сканирования с помощью линзы с увеличением в 2x, 5x, 10x и. Эти результаты в пиксель изображения размером до 4,5, 2,25 и 0,9 мкм соответственно. В зависимости от увеличения, образец должен быть соответствующего размера, а поле зрения уменьшается с ростом увеличения. Подробнее на выбор камеры и объектива и, как следствие параметров изображения в таблице 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Питер)
Объектив	пикселов (мкм)	Поле зрения (мм)	пикселов (мкм)	Поле зрения (мм)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16,6 (-)

Таблица 1. Подробная информация об имеющихсякамер и объективов на ALS 8.3.2.

2. Установка рентгеновского энергии до 15 кэВ. Это было показано, обеспечивает отличную контрастность изображения для большинства приложений предприятия (см. Brodersen и соавт. 2010, 2011, 2012A, б). Время экспозиции, как правило, зависит от толщины и плотности образца (и, следовательно, увеличение используются) в диапазоне от 100 до 1000 мс. Больше времени экспозиции (пока детектор пикселей не насыщен) обычно приводит к повышению отношения сигнал-шум, но за счет увеличения времени сканирования.
3. Выберите угловой шаг, который подходит для вашего приложения. Образцы поворотом на 180 ° во время сканирования, и количество снимков, сделанных во время вращения может иметь значительное влияние на размер набора данных, длина интервала сканирования, и окончательное качество изображения, но, как правило, убывающей доходности по качеству. Типичные сканирование выполняется на 0,25 ° шагом, получая 721 изображений на сканирование. Уменьшение incremenт до 0,125 ° приводит к улучшению изображения для визуализации мелких деталей, но дает 1440 фотографий и таким образом гораздо большего набора данных (для типичной области интереса, это означает, ~ 10-30 Гб данных по сравнению с 5 Гб). Тем не менее, отношение сигнал-шум часто улучшилось и стоит как увеличить время сканирования и размер данных. Сухие стебли, которые вряд ли будут деформироваться / сжатия при проверке могут быть подвергнуты более длительные интервалы (меньше углового приращения) без ущерба. При визуализации живых растений, где биологические процессы (например, эмболия ремонт) состоится короткая масштабах времени, выбирая более короткие промежутки времени сканирования предпочтительнее, чтобы ограничить потенциальные вредного воздействия рентгеновского излучения на ткани, хотя это происходит за возможную потерю качество изображения. Более короткие интервалы сканирования может быть достигнуто с помощью параметра Непрерывный томографии в течение которого образец непрерывно вращается в то время как съемки.
4. Для каждого сканирования, "светлое поле" и "темного поля" Размер изображения должен быть CorrecteD. Яркие образы поля изображения без образца в пучке. Они часто собираются до и после проверки образца на горизонтальном переводе образца. Темные поля собираются закрыть рентгеновского затвора этом измеряется уровень сигнала камера показывает, без рентгеновских лучей.

6. Обработка данных

1. Передача "сырой" 2D. TIF изображений, которые были вывезены с приобретением компьютера в файл сервер, компьютерная обработка данных. Если на компьютере установлено достаточно оперативной памяти, данные могут быть скопированы в так называемом "RAM Drive" (часть RAM выглядит как жесткий диск на компьютере). В этом случае программное обеспечение не имеет доступа к вращающийся жесткий диск, который идет сравнительно медленно по сравнению с твердотельным диском или флэш-памяти. Этот шаг значительно уменьшает количество времени, необходимое для обработки данных.
2. Изображения должны быть преобразованы в масштабах передачи процента. Beamline 8.3.2 имеет пользовательский баckground нормализации плагинов, которые могут быть загружены и использованы со свободно доступных пакетов программного обеспечения ImageJ или Фиджи ( http://fiji.sc/ ). Он вычитает темные импульсы с изображениями и нормализует примеры изображений ярким поля для получения изображения, которые показывают процент передачи. Загрузите нормированных изображений в пакет программного обеспечения Octopus ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) и "реконструировать" 3D набор из 2D в сыром виде. TIF файлов с помощью назначенных этапы обработки (нормализация изображений, удаление кольца , синограммы создании, реконструкции параллельного пучка). Этот процесс приводит к серии. TIF поперечных (поперечное сечение) изображения, состоящие из "вокселов" (объемных элементов пикселей), каждая из которых X, Y, Z координат и значения интенсивности представляют рентгеновские линейный коэффициент поглощения.

7. Визуализация

1. ВизуализациюZE стопку фотографий в одну из различных пакетов программного обеспечения. Freeware (например, дришти, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) может быть использован для визуализации объемов или индивидуального или стеки изображений (например, ImageJ или Фиджи). Другие пакеты программного обеспечения может быть использована для 3D-визуализации. Наша исследовательская группа использует пакет Avizo программного обеспечения ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), но другие, такие как Amira ( http://www.amira.com/ ) и VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ), также широко используется.
2. Загрузка данных в системной памяти и отображения образца в виртуальном поперечные, продольные, или радиальной ориентации среза. Благодаря 3D атрибутов набора данных, виртуальных срезов SAMPLе может быть повернут в любой плоскости, чтобы согласовать с регионами интерес, значительное улучшение по сравнению с традиционной последовательной световой микроскопии (см. Фильмы 1-3 подробные примеры).
3. Для визуализации образца по мере необходимости в 3D, "сегмент" примера с использованием различных полуавтоматических и ручных процедур в Avizo в отдельный сосуд люмен или других структур из окружающих тканей. Сегментация относится к определению границ между объектами интереса, таким образом, разделения или сегментация их в отдельных регионах. Рендеринг объемов в 3D осуществляется с помощью программного обеспечения визуализации. Один из способов сделать это является прямой рендеринг объема, где каждая точка в объеме предполагается, излучать и поглощать свет, размер и цвет излучения и поглощения может быть определен с помощью "карты цветов", и в результате проекции в данном направлении отображаться на экране. Кроме того, каркасные или 3D-поверхности сетки представляют сегментированные границы построена, чтобы показать 3D-модели тОн структуры интересов. 3D сетка состоит из полигональных элементов, а общее число элементов будет влиять как на верность структуре воспроизводства и размер соответствующего файла данных (т.е. более элементов приводит к более высокой точностью, но больше размер файла). Различные модули обработки изображения доступны в визуализации программного обеспечения для управления громкостью оказания выходов, а также контроль за яркость изображения, контрастности, прозрачности, уменьшения шума и т.д.

8. Квантификация

1. После сегментации было достигнуто, можно количественно целевой завод структур или функциональных изменений в объем, длина, ширина, наличие или отсутствие воды, воздуха и т.д. Например, Brodersen и соавт. (2010) использовали Avizo программного обеспечения для количественного Изменение объема капель воды внутри виноградной лозы заправки судов. Растения были отсканированы каждые 30 мин в течение четырех до восьми часов создании временной ла-PSE последовательность заправки судна. Каждая проверка была реконструирована и загружается в Avizo, где отдельные капли были измерены с течением времени, их объем увеличился.

Результаты

Synchotron КТВР сканирования были успешно реализованы на самых разнообразных тканей растений и видов использования beamline 8.3.2 (рисунок 5), и дали новому взглянуть на структуру и функции растений ксилема на беспрецедентное разрешение в 3D. Визуализации и анализа возможностей, предоста...

Обсуждение

Synchotron КТВР предоставляет завод биологи с мощным, неразрушающий инструмент для изучения внутренней работы завода сосудистую с невероятной детализацией. Эта технология была использована в последнее время для выявления ранее не описанных анатомических структур в виноградной лозе ксил...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2