JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем минимально инвазивной техники называют новорожденных субвентрикулярной электропорации зоне. Методика заключается во введении плазмидной ДНК в боковых желудочков у новорожденных щенков и применение электрического тока для доставки и генетически манипулировать нервных стволовых клеток

Аннотация

Нервные стволовые клетки (НСК) линии послеродового боковых желудочков и приводит к нескольким типам клеток, которые включают нейроны, астроциты и клетки эпендимных 1. Понимание молекулярных путей, ответственных за НСК самообновлению, целеустремленность и дифференциация имеет решающее значение для освоения их уникальные возможности для восстановления мозга и лучше понять расстройства центральной нервной системы. Предыдущие методы манипуляции системах млекопитающих требуется много времени и средств деятельности генной инженерии в целом уровень животного 2. Таким образом, подавляющее большинство исследований изучили функции молекулы НСК в пробирке или в беспозвоночных.

Здесь мы покажем, простой и быстрый метод управления новорожденных NPCs, что называют новорожденных субвентрикулярной зону (СВЗ) электропорации. Подобные методы были разработаны десять лет назад для изучения эмбриональных НСК и помогли исследования по corticaл развитие 3,4. Совсем недавно это был применен для изучения послеродовой мозга грызунов 5-7. Этот метод приводит к надежной маркировки SVZ НСК и их потомства. Таким образом, послеродовое SVZ электропорации предоставляет стоимость и время эффективной альтернативой для млекопитающих НСК генной инженерии.

протокол

Эта процедура осуществляется в соответствии с требованиями Йельского IACUC. Ученые должны убедиться, что IACUC руководящие принципы были утверждены и затем в соответствии с их институциональными требованиями.

1. Раздел 1. Получение ДНК, решения и стеклянных пипеток

  1. Создание высокой чистоты (OD 260/280> 1,80) высокой концентрации (мкг / мкл> 2,5) эндотоксина ДНК.
  2. Подготовка 0,9% солевой раствор и стерильных фильтров через 22 мкм фильтр.
  3. Место 10 см граненые боросиликатного стеклянные капилляры (OD: 1,5 мм, ID: 1,10 мм) в модели PP-830 Narishige PC-10 Съемник стеклянной пипетки с проводом Kanthal. Установить съемник на один шаг взвешенный тянуть на 70,5 ° C. Перерыв советов с круглыми щипцами и осмотр под микроскопом для рассечения неровными краями. Конические советы и место под УФ-лампой в течение 15 мин. Вытащил пипетки должны быть отмечены в 2 мм от края чаевых.
  4. Подготовка 0,1% вес / объем быстрой зеленых solutiна путем смешивания стерильной фильтрации 0,9% солевой раствор с сухой быстрой зеленых.

2. Раздел 2. Подготовка животных, стеклянной пипетки Загрузка и плазмиды инъекций

  1. Удалите 0-1 день после рождения щенка индивидуально из клеток, место на стеклянном блюде Петри предварительно охлажденный до 4 ° C, а затем место на льду.
  2. Примерно через 5 минут, определить состояние обезболивания, используя ногу ответ крайнем случае. Если не происходит движение, при условии щенков внутрижелудочковой инъекции.
  3. Важно отметить, что комбинация быстрых зеленых, ДНК и солевой раствор может привести к быстрому испарению, кристаллизация, и блокада стеклянных пипеток. Таким образом, генерировать раствора и 1-2 мкл аликвоты на парафильмом непосредственно перед инъекциями.
  4. Аспирируйте весь объем аликвоты с вырванными стеклянной пипетки.
  5. Держите голову из щенка между большим и указательным пальцем менее доминантной рукой.
  6. Включите лампуD держать голову из щенка только за пределами светового пучка. Если необходимо, положите на голову солевой, чтобы уменьшить количество света, отраженного от щенка. Желудочков теперь должны быть освещены.
  7. С Вашей доминирующей руки, вставить иглу в боковой желудочек ближайший к вам (рис. 1А и 1В). Месте инъекции должна быть примерно на равном расстоянии от ламбдовидного шва и глаз и 2 мм латеральнее сагиттального шва. Вставьте вытащил пипетки на 2 мм марки для P0 щенка, который должен обеспечить проникновение в боковой желудочек. Кстати, вы можете увидеть засыпке спинномозговой жидкости в пипетку от выпуска внутричерепного давления. Для снижения внутричерепного давления, которое оказывает помощь в инъекции плазмиды, ослабить свою хватку на голову pup.Step 2.8. Inject около 0,5 мкл плазмиды в боковой желудочек использования воздушного давлением инжектор (Picospritzer, Parker).

3. Раздел 3. Electroporation и восстановление

  1. Seт напряжение генератора для электропорации 5 квадратных импульсов, 50 мс / импульс на 100 вольт, с 950 мс интервалах. Пространственной специфики плазмиды электропорации диктуется направленностью переноса заряда. Пристальное внимание должно быть уделено размещению с учетом неоднородности популяции стволовых клеток вдоль SVZ 8. Различия в темпах распространения и судьбы клеток были определены для вентральной-спинной и хвостовой ростральной-мест 9,10.
  2. После того, плазмиды вводят, падение пинцет электродов в PBS. Этот шаг заключается в максимизации переноса заряда и предотвратить ожоги, вызванные сопротивлением.
  3. Поместите положительный электрод на спине боковой стенке щенка возле уха ипсилатерального на сайт плазмиды инъекции (рис. 1С и 1D). Поместите отрицательного электрода на противоположной полушарии вентральной сбоку от щенка мордой.
  4. Начало текущей передачи, нажав на импульс футовВедьма педаль и подметать электродов от спины к боковым использовании ~ 25 ° угла интервалами.
  5. Место электропорации щенков на грелку в течение 5 мин. Плавно поворачивайте щенков каждые 30 сек с легкой стимуляции.

Результаты

Новорожденных субвентрикулярной зоне электропорации результатов в маркировке почти все радиальные глии смежных с дорсальной, верхних боковых и боковых субвентрикулярной зоне после «зачистки» движения пинцет электрод (рис. 1E). Тем не менее, электропорации могут быть адаптир?...

Обсуждение

Здесь мы подробно технику новорожденных электропорации SVZ, технику, быстро и надежно маркировать и манипулировать SVZ стволовых клеток и их потомства. Есть несколько преимуществ, которые электропорации имеет по сравнению с другими методами. Во-первых, учитывая координационного маркиро...

Раскрытие информации

Авторы не имеют раскрытия сделать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Министерства обороны (награда идея развития, W81XWH-10-1-0041, AB), CT стволовых клеток гранта (AB) и Национального института здоровья АЯРБ 10668225 (DMF). Настоящий материал основан на работе частично поддержана штата Коннектикут под сотовый Коннектикут стволовых Программа исследовательских грантов. Его содержание несут исключительно авторы и не обязательно отражают официальную точку зрения штата Коннектикут, Департамент здравоохранения штата Коннектикут или КТ Innovations, Inc спонсоры не играли никакой роли в разработке дизайна исследования, сбор данных и анализа, решение о публикации или подготовки рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Тяжелые полированные трубы из боросиликатного Саттер инструменты BF150-110-10
Двухступенчатая стекла микропипетки съемник Narishige PC-10H
Быстрый зеленый Фишер Научные 0521192205
ECM 830 квадратных волны генератора импульсов Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Волоконно-оптический источник света Fisher Scientific 12-562-36
Вольфрамовые галогенныелампа USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Паркер инструменты 052-0312-900

Ссылки

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience72

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены