Послушный млекопитающих инфекции сотовый с Протозойные грунтовка бактерии

Резюме

Этот метод предоставляет метод для сбора, нормализации и количественного роста внутриклеточных бактериальных патогенов, которые предварительно выращивают в естественных клеток-хозяев простейших до инфекциями клеток млекопитающих. Этот метод может быть модифицирован, чтобы приспособить широкий спектр клеток-хозяев для грунтования этапе, а также типы клетки-мишени.

Аннотация

Многие внутриклеточные бактериальные патогены использовать пресноводных простейших как естественный резервуар для распространения в окружающей среде. Legionella легионелл, возбудителя легионеллеза пневмонией, получает преимущество над патогенными в пробирке культурных бактерий при первом собирают из простейших клеток до заражения млекопитающих макрофагов. Это говорит о том, что важным фактором вирулентности не может быть надлежащим образом выраженного в пробирке. Мы разработали послушный системы для грунтования L. легионелл через свой ​​естественный хозяин простейших Acanthamoeba castellanii до млекопитающих инфекции клетки. Вклад любого фактора вирулентности могут быть рассмотрены путем сравнения внутриклеточного роста мутантного штамма дикого типа бактерий, простейших после грунтования. GFP-экспрессирующих дикого типа и мутанта L. легионелл штаммы используются для заражения простейшими монослоев в грунт шагом и позволило достичь поздних стадиях внутриклеточного роста. Флуоресцентные бактерий, затем собирают из этих инфицированных клеток и нормированы спектрофотометрии для получения сопоставимого количества бактерий для последующей инфекции в млекопитающих макрофагов. Для количественного определения, живые бактерии контролируются после заражения с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии, и колонии покрытия. Этот метод выдвигает на первый план и зависит от вклада клетки-хозяина экспрессии генов путем имитации окружающей среды, которые будут встречаться в естественный путь приобретения. Этот подход может быть изменена, чтобы приспособить любую бактерию, которая использует промежуточного хозяина, как средство для получения патогенных преимущество.

Введение

Многие патогенные бактерии приспособились обобщенных стратегий для использования клеток-хозяев для выживания и репликации внутриклеточных отсеке. Во многих случаях, патогенетические механизмы аналогичны между простейшими и многоклеточными клеток. Однако, эти два микросреды очень разные и могут привести к дифференциальной экспрессии факторов вирулентности ^1-4. Болезнь легионеров бактерия Legionella легионелл является повсеместно, связанных с пресноводной среде по всему миру ^5. Важно отметить, что L. легионелл выращивают в простейших клеток до заражения человеческих моноцитов получить патогенных преимущество, предполагая, что глобальные профили экспрессии генов бактерии выхода клетки простейших отличаются, чем в пробирке выращивают ^6-8 организма. В природе, пресноводных амеб обеспечивают богатые питательными веществами пределы для быстрого усиления вторжения бактерий. Человека приобретении L. pneumophила наиболее часто связывают с вдыханием загрязненного капель воды, которые содержат бактерии. Вполне вероятно, что эти капли гавани простейших клеточно-ассоциированных бактерий, простейших, где клетки более устойчивы к обычной воды практик ^9,10. Инфекция легких альвеолярные макрофаги доходы таким образом, практически идентична внутриклеточной жизненный цикл бактерий в простейших клеток-хозяев ^11-13.

Для того чтобы выжить и размножаться в клетках эукариот, L. легионелл использует специализированный тип секреции IVb система называется Dot / ICM, чтобы доставить почти 300 «эффекторные» белков в цитоплазме клетки-хозяина ^14-16. Эти эффекторные белки коллективно работать, чтобы разрушить клеточные процессы в целях получения разрешительной репликации отсек для бактерий ^17,18. Удаления в любом из 26 генов, которые составляют Dot / ICM транспортера приводит к дефектных штаммов для внутриклеточных мультiplication ^19-23. Исторически сложилось, что удаление отдельных эффекторных генов, кодирующих редко в результате ослабленного штамма для внутриклеточного роста. Это явление было приписано несколько гипотез, в том числе избыточных функций и паралогичных копии эффекторов.

Некоторые факторы вирулентности, только выраженная в контексте клетки-хозяина связанного внутриклеточного роста ^24. Мы рационализировать, что если тот или иной эффекторных только выражается в контексте инфекции простейших, то вклад эффекторных не может быть по сравнению с штамма дикого типа, когда оба культивировали в пробирке. L. легионелл переходы от репликативной к пропускающий фазе, поскольку это входит стационарная фаза в культуре ^25. Фенотип фазы переключения представляет истощение питательных веществ, возникших в ходе внутриклеточного роста и является примером по сборке жгутиков для подвижности ^26. Поскольку L. легионелл более инваSIVE и опасной, когда собирают из простейших клеток, мы стремились разработать тест, который более точно представляют патогенные состояния бактерию, когда он встречается множество макрофагов.

С этой целью мы разработали универсальный тест грунтовки простейших, которые могут вместить любой подходящей принимающей как для первого (заливка ячейки) и второй (клетки-мишени) инфекции этапе. Инфекционный процесс является послушным за счет использования бактерий, стабильно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). Инфекции модели для простейших Acanthamoeba castellanii следует методология широко используется в области ^27. Для грунтования шаг, Л. легионелл штаммы выращиваются в пробирке в стационарной фазы в жидкую среду, чтобы произвести как 'пропускающего »бактерии (рис. 1А). Бактерии следующий использовали для инфицирования монослоев A. castellanii в течение 18 часов для достижения поздней стадии внутриклеточного жизненного цикла. Большие вакуоли содержатния бактерий могут быть визуализированы в этот момент времени с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1А). Протозойные Затем клетки лизируются и бактерии извлекают из лизатов измеряется выбросов при 512 нм с использованием флуоресценции ридере. Флуоресценции коррелирует с оптической плотности для расчета кратности-оф-инфекции (MOI) для заражения клетки-мишени (рис. 1, * Корреляция кривой). После вторжения (T ₀₎ и 18 ч после вторжения (T _18), клетки-мишени количественно для флуоресценции, представляющих внутриклеточных бактерий. Флуоресценции можно контролировать с помощью микроскопии и проточной цитометрии и жизнеспособных микроорганизмов может быть измерена через колонию покрытия. Грунтовка анализ всегда сопровождается инфекции дикого типа L. легионелл и деформации дефекты Dot / ICM Тип IV секреторной системы (Δ DotA) (рис. 1А). Это важно обеспечивает внутренний контроль за прямое сравнение между дикого типаой любом изогенных мутантные штаммы, используемые в процессе заражения. Включение авирулентным Δ DotA напряжение во время заливки этапа устанавливает порог для наблюдения ослабленный рост фенотипы, связанные с изогенных мутантные штаммы, которые культивируются в лабораторных условиях.

протокол

1. Подготовка Legionella культуры легионелл для инфекций Грунтовка этап

1. Преобразование всех L. легионелл штаммы, используемые в анализе плазмидой pAM239, кодирующий изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индуцибельной зеленого флуоресцентного белка (GFP) ^28. Подряд бактериальных штаммов на железо и цистеина дополнен N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота (ACES) буфером угля дрожжевой экстракт агар (CYEA), содержащий 6,25 мкг / мл хлорамфеникола (CM) (для плазмиды обслуживания) и инкубировать в течение 72 ч при 37 ° C.
2. Передача посевной бактериального штамма в дополнено ACES буфер бульон дрожжевого экстракта (Ай) с 6,25 мкг / мл CM и 1 мМ IPTG и культивировать в стационарную фазу (O / N) на орбитальном шейкере при 37 ° C.
3. Подтвердите GFP выражение в культурах в пробирке с помощью флуоресцентной микроскопии. Передача 10 мкл культуры на предметное стекло под крышкойскольжения и изображения, используя 60X объектив с возбуждением GFP / выбросов куба (AMG EVOS П).
4. Развести в 100 мкл каждого из них в культуре пробирке до 1:10 с использованием стерильной H ₂ O. Сделать пустым, используя 100 мкл AYE средствах массовой информации с 1 мМ IPTG и 6,25 мкг / мл см и воды. Возьмите OD600 измерений разведения с использованием спектрофотометра (Bio-Rad Смарт-Spec Plus). Рассчитать объем необходимых для заражения также в МВД = 20 для каждой культуры в пробирке: V = [(амебы посева) х МВД России] / [OD ₆₀₀ х (коэффициент разбавления) х (постоянное)] = [(1 х 10 ⁶ ) х (20)] / [OD ₆₀₀ х (10) х (1 х 10 ^6)] = 2/OD _600. Концентрация бактерий определяется как OD ₆₀₀ = 1,0 = 1 × 10 ⁹ КОЕ / мл.

2. Грунтовка стадии инфекции, используя Acanthamoeba castellanii

1. Поддерживать и развивать амеб в ATCC 712 PYG среду в 175 см ² колбы при комнатной температуре.
2. Заменить СМИ в амеб культурывания 24 часа до начала бактериальная жидкость культур. В тот же день жидких бактериальных культур начался сбор и подсчет клеток на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.
3. Развести амеб свежей средой до конечной концентрации 1 х 10 ⁶ клеток / мл. Семенной 12-а культура клеток пластин с 1 мл аликвоты из амеб помощью пипетки повтор и инкубировать при комнатной температуре O / N.
4. После инкубации промыть лунки 12-луночных культуре клеток пластины 3 раза с 1 мл стерильной PBS с использованием 10 мл серологической пипетки и эксплуатации помощью пипетки.
5. После стремление PBS, добавить 1 мл инфекции СМИ (ATCC 712 PYG СМИ минус глюкоза, пептон и дрожжевой экстракт) с 1 мМ IPTG и 6,25 мкг / мл см в каждую лунку. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Infect скважин на MOI = 20. Центрифуга пластины при 400 мкг в течение 5 мин (Eppendorf 5810R) и плавать в 37 ° С водяной бане в течение 5 мин. Передача пластины на 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение 18 часов.
7. Подтвердите инфекции использованием изображений живых клеток на флуоресцентного микроскопа до проведения лизиса клеток и урожай бактерий.

3. Посев ТНР-1 клеток для целевой инфекции клеточной стадии

1. (Начало этому процессу 24 часа до создания жидких бактериальных культур). Развивайте ТНР-1 клеток в 75 см ² колбы с культурой почти до слияния в RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
2. Граф суспензии клеток с помощью гемоцитометра, развести ТНР-1 клеток в RPMI 1640, с 10% FBS и 100 нг / мл форболового-12-миристат-13-ацетат (PMA) в концентрации 1 х 10 ⁶ клеток / мл , и пластина в 1 мл аликвоты по 12-луночных культуре клеток. Инкубируйте пластины в течение 48 ч при температуре 37 ° C, 5% CO _2.

4. Обработка Бактерии для целевой инфекции клеточной стадии после заражения этап Грунтовка

1. Аспирируйте средств массовой информации из загрунтовать амеб.
2. Lysemoebae использованием 500 мкл ледяной, стерильные ультра-фильтром (UF) H ₂ O и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
3. Бассейн лизатов в соответствии с типом напрягаться и принимать E _{512 нм} измерений для каждого из объединенных лизатов использованием флуоресцентного планшет-ридера (Molecular Devices Spectramax Близнецы EM).
4. Рассчитать OD ₆₀₀ измерений для объединения лизатов: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - лизат фоне) + 0,0019. Эта формула была ранее определена путем построения графика прямое сравнение обеих OD ₆₀₀ и E _{512 нм} измерений разведения L. легионелл дикого типа выражения GFP из стационарной фазы в пробирке культуру (рис. 1 *). Лизатов неинфицированных амебы, с учетом тех же экспериментальных условиях, зараженных амеб, которые используются в качестве пустого и при условии коррекции значения (например, лизат фоне), которая была включена в уравнение. Объем необходимых тO заразить а в МВД = 20 рассчитывается для каждого лизата бассейна: V = [(THP-1 посева) х МВД России] / [calcOD ₆₀₀ х (постоянное)] = [(1 х 10 ⁶⁾ х (20)] / [calcOD ₆₀₀ х (1 х 10 ^6)] = 20 / calcOD _600.
5. Вымойте ТНР-1 клеток 3x с PBS и добавляют 1 мл свежей RPMI 1640 (10% FBS) в каждую лунку. Инкубируйте ТНР-1 клеток в течение 1 часа при 37 ° C, 5% CO _2.
6. Infect ТНР-1 клеток при расчетной МВД использованием объединенных лизатов. Разрешить множество скважин оставаться неинфицированных, выступающей в качестве отрицательного контроля для проточной цитометрии. Обработка грунтовки этап должен быть завершен менее чем за 30 мин. Лизатов хранятся на лед, чтобы ограничить любые изменения в экспрессии генов бактериальной перед инфекцией.
7. Центрифуга пластины, плавать поднять температуру, и инкубировать как в заливной этапе.
8. Через час после инфекции, удалить СМИ, стремление и мыть скважин 3x с PBS для удаления внеклеточных бактерий.
9. Добавить 1 мл частотыШ. RPMI 1640 (10% FBS) в скважинах и вернуть пластину в инкубатор. Время сразу после замены носителя служит нулевой момент времени (T _0). Инкубируйте ТНР-1 клеток в течение 14-16 ч при 37 ° C, 5% CO _2.

5. Экспериментальный анализ

5,1 изображений живых клеток

Изображение инфицированных скважин с помощью флуоресцентного микроскопа (AMG EVOS Флорида) на 10х или 20х увеличении (рис. 1А-D). Изображения можно сравнить качественно или количественно определить уровни инфекции в обоих стадии грунтовки и целевых инфекций клеточной стадии.

5,2 проточной цитометрии

1. Выбросы пиков различных инфекций можно сравнить с помощью проточной цитометрии (BD FACS Calibur). Trypsinize инфицированных ТНР-1 клеток и аккуратно промойте их из скважины путем смешивания в PBS с помощью пипетки.
2. Бассейн клеток штамма типа в 15 мл Сокол труб и гранул при 1800 мкг в течение 2мин в центрифуге столешницы.
3. Приостановить гранул в 1 мл PBS и передать пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге.
4. Центрифуга суспензий при 1800 х г (Eppendorf 5424) и вновь приостановить гранул в 1 мл PBS. Если в результате суспензии очень мутная (OD ₆₀₀ ≥ 1,0) они должны быть разведены в дополнительных PBS (1:3), чтобы предотвратить засорение линии в проточной цитометрии.
5. Использование стерильной фильтрации PBS для уравновешивания проточной цитометрии и для промывания между образцом инъекции. Постройте вперед / стороны разброс неинфицированных клеток-мишеней до введения целевых образцы клеток инфекции.
6. Соберите 20000 Всего событий, для каждого условия использования 488 нм лазерного возбуждения и канала FL1.
7. Ворота после захвата клеточных популяций, чтобы исключить неинфицированных клеток и земельный участок интенсивности флуоресценции в гистограмме (FlowJo) (рис. 1E).

5,3 КОЕ покрытием

1. Изучить эффективность выводаF инфекции КОЕ покрытием из клетки, собранные для проточной цитометрии. Подготовка серийные разведения образцов в ультра-фильтром H ₂ O в 10 ^-1, 10 ^-2 и 10 ^-3.
2. Пластина 20 мкл каждого разведения на 1/3 от пластины CYEA с 6,25 мкг / мл CM.
3. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 72 часов.
4. Подсчет колоний помощью зубочистки и клеточной счетчика.

Результаты

Типичный результат для всего процесса инфекция указаны на рисунке 1. Жить флуоресценции клеток микрофотографии изображающие монослоев A.castellanii инфицированных дикого типа L. легионелл в грунт этап показан на рисунке 1а. Успешная мера грунтовки шаг привел бы к ...

Обсуждение

Бактериальная экспрессия гена жестко контролируется посредством сочетания жизнь цикла и ответ на сигналы в окружающей микросреде. Вакуолярной патогенов, таких как L. легионелл ответить на множество клетки-хозяина полученные сигналы, когда разобщенным в фагосомы. В коллективном ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes