Оценка Мышиные функции артерий сопротивления с помощью давления Миография

Резюме

В миография давления, нетронутым небольшой сегмент судне установлена ​​на двух небольших канюли и давлением до подходящего просвета давления. Здесь мы описываем метод измерения вазорелаксацию реакция мыши 3 ^Й Заказ брыжеечных артерий в C57 и sGCα _{1 - / - Мышей с использованием давления миография.}

Аннотация

Системы под давлением миографа изысканно полезным в оценке функциональной мелких артерий, давление до подходящей трансмуральная давления. Рядом физиологическое состояние достигается давления миография позволяет углубленный характеристику внутренней ответов на фармакологических и физиологических стимулов, которые могут быть экстраполированы на поведение в естественных условиях сосудистого русла. Давление миографа имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными myographs проволоки. Например, мелкие суда сопротивление может быть учился в жестко контролируется и физиологически значимых внутрипросветные давления. Здесь мы изучаем возможность ^3-го порядка брыжеечных артерий (3-4 мм длиной), с preconstricted фенилэфрин, чтобы сосудосуживающих расслабиться в ответ на ацетилхолин. Брыжеечной артерии установлены на двух канюли соединен с давлением и закрытой системе, которая поддерживается при постоянном давлении 60 мм рт. Просвет и внешний диаметр сосуда continuouхитрый, записанные с помощью видеокамеры, позволяющий в реальном количественного время вазоконстрикции и расширение сосудов в ответ на фенилэфрин и ацетилхолин, соответственно.

Чтобы продемонстрировать применимость давление миография для изучения этиологии сердечно-сосудистых заболеваний, мы оценили эндотелий-зависимой сосудистой функции в мышиной модели системной гипертензии. Мыши, дефицитные по α ₁ субъединицы растворимой гуанилатциклазы (sGCα ₁ ^{- / -)} являются гипертоническая когда на 129S6 (S6) фоне (sGCα ^-/-S6 _1), но не тогда, когда на C57BL / 6 (B6) фоне (sGCα ₁ ^-/-B6). Использование давления миография мы покажем, что _1-sGCα дефицит приводит к нарушению эндотелий-зависимой расширение сосудов. Сосудистая дисфункция является более выраженным в sGCα ₁ ^-/-S6, чем в ₁ sGCα ^-/-B6 мышей, вероятно ВКЛАДнг до более высокое кровяное давление в sGCα ₁ ^-/-S6, чем в ₁ sGCα ^-/-B6 мышей.

Давление миография является относительно простым, но чувствительным и механистически полезный метод, который может быть использован для оценки влияния различных раздражителей на сосудистый сокращение и расслабление, тем самым увеличивая наше понимание механизмов, лежащих в основе сердечно-сосудистых заболеваний.

Введение

Системы под давлением миографа используются для измерения физиологических функций и свойств малых артерии, вены и других судов. Нетронутым небольшой сегмент артерии или вены установлена ​​на двух небольших канюли стекла и давление повышают до подходящего просвета давления, позволяя сосуд для поддержания большей части в естественных характеристик (фиг. 1 и 2). Рядом физиологическое состояние у давлением миографа отражает в естественных условиях поведение сосудистого русла, что позволяет исследование внутренних свойств (например, миогенной тона) изолированных сосудов. Некоторые из преимуществ давление миография над провод миография, где сокращение мышц оценивается путем прямого механического соединения с динамометрическим датчиком ^1, включают (I), что микро сопротивление артерий, которые определяют общее сопротивление разработаны в сосудистой системе, могут быть изучены, в то время провод миографа ограничивается трубопровод большого диаметра артерии, (II) тшапка риска повредить эндотелий уменьшается, поскольку провода не нужно проходить через просвет сосуда, (III), что естественные формы сосуда лучше поддерживается, и (IV), что судно измерение может быть изучена в широком диапазоне давления или напряжения сдвига ^2.

Изучение микро сосуды могут быть более информативными, чем изучение больших артерий трубопровода, чтобы помочь понять патофизиологии и молекулярные механизмы, которые способствуют измененный сосудистый тонус сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония. Например, нарушение функции эндотелия, связанных с кормлением мышей высоким содержанием жиров в течение 8 недель может быть продемонстрировано во ^2-й порядка брыжеечных артерий ^3, но не в аортального кольца (рис. 3). Еще одно преимущество миография давления является то, что внутренние миогенном сужение сосуда под давлением присутствует, и что роль и функции эндотелия в этом явлении могут быть изучены. Здесь мы DescrIBE использования давления миографа для изучения реактивности сосудов мыши брыжеечной артерии ^3-го порядка сопротивление в условиях нарушенного оксида азота (NO)-цГМФ сигнализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Получение раствора

1. 500X ЭДТА складе: весит 500 мг ЭДТА-Na ₂ • 2H ₂ O и растворить в 50 мл деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
2. KCl деполяризующие решение.
   1. Подготовьте K10X раствора: 3,69 г NaCl, 18,64 г KCl, 0,36 г безводного MgSO _4, 0,41 г KH ₂ PO _4, 0,46 г CaCl ₂ • 2H ₂ O. Растворите в 250 мл деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
   2. В 100 мл конечного деполяризующего раствора KCl 1X: растворите 0,21 NaHCO _3, 0,18 г глюкозы в 90 мл деионизированной воды. Добавить 10 мл раствора K10X. Добавить 95 мкл раствора 500Х ЭДТА. Хорошо перемешать. Хранить при температуре 4 ° C. Использовать в течение одной недели.
3. Подготовка свежих HEPES-PSS решение на день эксперимента (за 1 литр).
   1. 6,96 г NaCl, 0,35 г хлорида калия, 0,288 г MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,1605 г KH ₂ PO _4, 2,38 г HEPES. Растворите в 100 млдеионизированной воды. Взять колбу А.
   2. 0,312 г CaCl ₂ • 2H ₂ O. Растворить в 100 мл деионизированной воды. Отметить как колбу B.
   3. 1,25 г NaHCO _3, 0,991 г глюкозы. Растворить в 98 мл деионизированной воды. Отметить как колбу C.
4. Добавить 2 мл 500X ЭДТА в колбе C. Возьмите 700 мл деионизированной воды в большой колбе. Налить содержимое колбы A, B и C в большой колбе с непрерывным встряхиванием. Доводят рН до 7,4 с помощью NaOH.

2. Препараты, применяемые

1. Фенилэфрин (10 ^-2 М): растворите 20,37 мг в 10 мл деионизированной воды. Алиготе 1 мл и хранят при температуре -80 ° С. Серийно разбавить до получения 10 ^-3 10 ^-4 10 ^-5 и 10 ^-6 моль / л в день эксперимента.
2. Ацетилхолин (10 ^-2 М): растворите 18,17 мг в 10 мл деионизированной воды. Алиготе 1 мл и хранят при температуре -80 ° С. Серийно разбавить до получения 10 ^-3 10 ^-4 10 ^-5 и 10 ^-6моль / л в день эксперимента.

3. Мыши

Мужской WT и sGCα ₁ ^{- / -} мышей на S6 и B6 фоне были изучены в настоящем исследовании. SGCα ₁ ^{- / -} были получены, как описано выше ^4,5. Жилищного строительства и процедуры, связанные с экспериментальных животных (мышей) были одобрены подкомитетом по исследованиям животных Уход за Massachusetts General Hospital, Бостон, Массачусетс.

4. Измерение сосудистую реактивность в брыжеечная артерия

1. Эвтаназии мышей пентобарбиталом (200 мг / кг, внутрибрюшинно). Откройте брюшной полости и Рассеките из брыжеечной ткани. Изолировать и анализировать брыжеечной артерии ^3-го порядка бесплатно соединительной и жировой ткани и поместите артерии в ледяной HEPES-PSS решение предварительно уравновешенную 95% O _2/5% CO ₂ в течение 15 мин. Cut кольца 2-3 мм длиной, не отходящих от брыжеечныхартерии. Дифференциация между артериями и венами на микроуровне суда является проблематичным, когда нет крови в сосудах. Поэтому мы рекомендуем выявления судна, пока он еще нетронутым в животном Перед рассмотрением его.
2. Наполните стаканчик канюли в напорной камере миографа (DMT Модель 110P и 11P версии 1.31, рисунок 2) с HEPES-PSS раствор с помощью 10 мл шприц через впускные и выпускные клапаны. Заполнение канюли должно быть сделано аккуратно и тщательно, как чрезмерное давление может повредить хрупкую преобразователь подключен к канюли. После заполнения канюли закрыть оба впускных и выпускных клапанов плотно.
3. Установите один конец сосуда на правой канюли и тщательно связать его с одним мелкий нити из нейлона шва. С помощью шприца, промыть и заполнить сосуд с HEPES решение через впускной клапан. Привести в левой канюли ближе к судну и смонтировать на другом конце судне на него. Связывайте его с нейлоновой ниткой. Заполнениекамера с до 10 мл с раствором HEPES. Проверьте наличие утечки осторожно нажав HEPES решение через впускной клапан при помощи шприца.
4. Установите камеру на миографа и под видеокамеру. Запустите кислорода и тепла (37 ° С) в камере. Соединение впускного клапана с трубкой Р1 из первого резервуара раствор HEPES, когда клапан закрыт. Пусть каждый пузырь и решения проходят через трубку, пока нет никаких пузырьков в трубке. Откройте клапан.
5. Подключите левый клапан камеры с трубкой P2 Исходя из регулятора давления. Снова проверьте, нет ли пузырьков. Там не должно быть никаких пузырьков или утечки в системе в целом.
6. К давлению меню на мио-интерфейс панели или в программном обеспечении и включить насос при включении подачу.
7. Откройте программу и нажмите кнопку Collect. Судно следует рассматривать на экране сейчас (рис. 3). Судно визуализируется с камерой установлены на микроскопе, позволяя Monitoriнг и анализ просвет сосуда, диаметр сосуда, и толщины стенки.
8. Постепенно вводите interluminal давления через клапан P1, выбрав давление Р1 в мио-интерфейс панели или в программу и введите значение давления следующим образом: 5 мм → 10 → 20 → 40 → 60 мм рт. Судно имеет тенденцию когда-нибудь крутить или свертки в то время как давление растет; регулировки натяжения или напряжения соответственно с помощью вертикальных или продольных микроподвижки (рис. 2). Равновесие сосуде при 60 мм рт.ст. и 37 ° С по крайней мере в течение 45 мин. Изменение раствор ванны один раз подогретого HEPES при уравновешивания.
9. Применяют 10 мл деполяризующего раствора KCl, предварительно нагретой при 37 ° С в ванну, чтобы полностью деполяризации клеток гладких мышц и достижения максимального сужения. После стабильного сужения, промыть ванну с HEPES раствора 3 раза каждые 10 мин.
10. Проверка жизнеспособности судна и целостности эндотелия стабильным и репродуктивногоIBLE ответов на добавлением фенилэфрина (10 ^-5 М) и ацетилхолин (10 ^-5 М). Промыть 3 раза HEPES раствора каждые 10 мин.
11. Добавить фенилэфрина (10 ^-5 М) в preconstrict судна, и при стабильном сужение был получен, выполнение совокупный концентрации сосудов кривая отклика (CRC) последовательным добавлением увеличением дозы ацетилхолина (10 ^-9, 3 х 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 × 10 ^-8, 10 ^-7, 3 × 10 ^-7, 10 ^-6, 3 × 10 ^-6, и 10 ^-5 М). После последней дозы, промыть 3 раза раствором HEPES каждые 10 минут, прежде чем начать новую CRC.
12. Определить диаметр просвета пассивным путем применения Ca ^{2 +-Free} PSS, содержащем 2 мМ ЭДТА. Из записанных мере обводка диаметр просвета для каждого доза-ответ (рис. 4), который будет использоваться для расчета всех параметров.
13. Выразить все ответы ацетилхолина релаксации, PERCentage изменение диаметра просвета после фенилэфрина preconstriction по сравнению с разностью между бескальциевой диаметра и диаметра после фенилэфрина сужение, используя следующее уравнение:
14. Процент расширение = 100% х [(D _х - D _I) / (D _Ca-Free - D _I)], где D является измеренный диаметр просвета и X, I и Са-Free обозначают артериальную диаметров при каждой дозе агониста (х), начальное следующего диаметра фенилэфрин сужения (I), а в Ca ^{2 +} буфере (CA-бесплатно).

5. Статистический анализ

Все непрерывных измерений представлены в виде среднего ± SEM. Сосудистую реактивность в брыжеечных артерий анализируется повторных измерений двусторонний ANOVA. Во всех случаях Р <0,05 считают статистически значимым.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

НЕТ центре участвуют в поддержании гомеостаза крови давление как у человека ⁶ и на животных моделях ^7. Способность NO контролировать сосудистую релаксацию гладких мышц опосредована растворимой гуанилатциклазы (рГЦ), гем-содержащих Гетеродимерный фермент, который генерируе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мыши являются экспериментальной моделью выбора для многих исследователей, в частности, из-за возможности введения генетических модификаций, тем самым генерируя модели мыши для человека патофизиологии. Вазоактивных статуса малым сопротивлением, но не более крупных сосудов канала в з?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT