Фототромботического ишемии: малоинвазивной и воспроизводимые фотохимические Кортикальная Модель Поражение исследований Мышь ход

Резюме

Фототромбоза является быстрым, минимально-инвазивной техники для стимулирования малого и четко обозначенной миокарда в областях, представляющих интерес в сильно воспроизводимым образом. Он особенно подходит для изучения клеточных и молекулярных ответов, лежащие в основе пластичности мозга у трансгенных мышей.

Аннотация

Фототромботического модель удара направлена ​​вызывать ишемическое повреждение в данной области коры посредством фото-активации ранее вводили светочувствительным красителем. После освещения, краситель активизируется и вырабатывает синглетного кислорода, который повреждает компоненты эндотелиальные клеточные мембраны с последующей агрегации тромбоцитов и образование тромбов, которые в конечном итоге определяет прерывание местного кровотока. Этот подход, первоначально предложенный Розенблюм и El-Саббан в 1977 году, был позже улучшена Уотсона в 1985 году в головном мозге крыс и установить основе текущей модели. Кроме того, повышение доступности линий трансгенных мышей также способствовало повышению интереса со фототромбоза модели. Вкратце, фоточувствительный краситель (Бенгальский Розовый) вводят внутрибрюшинно и поступает в кровь. При освещении источник холодного света, краска активируется и вызывает повреждение эндотелия с активацией тромбоцитов и тромбоз, в результате чего местныепрерывание кровотока. Источником света может быть применен на неповрежденную черепа без необходимости трепанации черепа, что позволяет таргетинга любой области коры интереса к воспроизводимым и неинвазивным способом. Затем мышь зашивается и позволил, чтобы проснуться. Оценки ишемического повреждения могут быть быстро достигнуто путем трифенил-тетразолия хлорида или крезиловый окрашивание фиолетовым. Этот метод вызывает инфаркт небольшого размера и строго определенной границы, которая является весьма выгодным для точной характеристики клеток или функциональных исследований. Кроме того, оно особенно подходит для изучения клеточных и молекулярных ответов, лежащие в основе пластичности мозга у трансгенных мышей.

Введение

В начале 21 века, ишемического инсульта является разрушительным расстройство, которое представляет собой вторую причину долгосрочной инвалидности ¹ и второй причиной смертности во всем мире, в котором инсульт приходится примерно 5,7 миллиона случаев смерти в 2004 году ^2. Несмотря на многие усилия, которые были размещены, до сих пор нет эффективного лечения для улучшения функционального восстановления после инсульта. Животных моделях инсульта широко применяются в области инсульт исследований, поскольку они позволяют моделирование патофизиологии ишемического повреждения и проверки эффективности различных стратегий нейропротекторное в естественных условиях. Большинство из этих моделей целью вызвать обширный инфаркт путем прерывания (временно или постоянно) кровотока в средней мозговой артерии, тогда как другие модели были разработаны для изучения поражений небольшого размера в определенных областях, обычно двигателя и соматосенсорной коры. Однако, некоторые факторы могут способствовать для генерации переменногоertain степень изменчивости экспериментальных исследований инсульта, в том числе мыши штамм, используемый, возраста и пола животных, включенных в исследование, и, прежде всего, методика, принятая, чтобы побудить ишемического повреждения. Что касается последнего пункта, продолжительность и инвазивность хирургического вмешательства (то есть потребность в краниотомия), а также хирургических навыков, необходимых для оператора, чтобы надежно вызывать ишемическое поражение являются критическими детерминантами для успешного и объективной в естественных ход исследования .

Концепция фототромбоза изначально предложенный Розенблюм и Эль-Саббан в 1977 году ³ и стал известным его применением в головном мозге крыс Уотсон и др. в 1985 году ^4, в которой техника была в значительной степени улучшены и заложил основы нынешней модели ^{3. - 6.} Фототромботического подход стремится вызывать корковых миокарда через фото-активации светочувствительного красителя ранее поставленных в кровеносной системе, белыйICH вызывает локальное тромбоз сосудов в местах, подвергающихся воздействию света. Когда циркулирующей краситель освещается в соответствующей длины волны на холодный источник света, он высвобождает энергию молекул кислорода, что в свою очередь большое количество высоко реакционноспособные продукты синглетного кислорода. Эти промежуточные кислорода индуцировать эндотелиальные перекисное окисление клеточных мембран, что приводит к адгезии и агрегации тромбоцитов, и в конечном счете к образованию тромбов, которые определяют локального мозгового прерывание потока ^7.

Фототромбоза является неканоническим ишемическая модель, которая не закрывает перерыв или только одной артерии как это обычно бывает в человеческой инсульта, но вызывает поражения в более поверхностные сосуды, что приводит к селективному нарушению кровотока в областях под воздействием света. По этой причине данный подход может быть пригодным для клеточных и молекулярных исследований корковой пластичности. Основным преимуществом этого метода состоит в его простоте исполнения.Кроме того, фототромбоза может быть легко выполнен примерно в сорока минутах на одно животное, в том числе двадцать минут ожидания (3 мин для анестезии; 1 мин брить головы, от 3 до 5 минут, чтобы разместить животных на стереотаксической аппарата; 2 мин, чтобы вычистить скальп с антисептическим раствором, сделать надрез и очистить череп; 2 до 4 мин поместить холодную волоконных световодов; 1 мин придать решению бенгальским розовым, 5 мин ожидания для внутрибрюшинного диффузии; 15 мин освещения и 5 мин до очистить рану и шовный животное). Кроме того, ни хирургического опыта не требуется выполнять эту технику, как поражение индуцируют с помощью простых освещения интактного черепа. В отличие от классических артериальной окклюзии, этот метод определяет селективной окклюзии мягкой мозговой оболочки и интрапаренхимальные микрососудов в зоне облучения и снижает вариабельность поражения как без залога судна не осталось поставлять кислород в целевом регионе.

Несмотря на свой особый характер,фототромботического акции пострадали жизненно важные механизмы, происходящие в мозгу инсульт. Аналогично артерии в человеческом инсульт, агрегацию тромбоцитов и образование сгустка определить прерывание потока крови в облученной области ^7. Кроме того, эта модель также разделяет существенный воспалительные реакции, что и в средней мозговой артерии ^8. Однако из-за хорошо разграниченная границ, полутени зоне, которая соответствует области частично сохранена обмена веществ, очень пониженной или несуществующим после фототромботического поражения. Это ясно граница может облегчить изучение клеточных ответов в ишемический или интактные области коры. Модель фототромбоза мышь является особенно подходящим для инсульта исследований в различных трансгенных животных. Действительно классических моделей не может поместиться на все штаммы и долгий период исследований в C57BL / 6 линий мышей сообщили о высокой смертности, которые могут вызвать смещение ^9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Предварительно хирургии

1. Взвесить Бенгальский Розовый в 1,5 мл пробирку и не растворяется в стерильном солевом растворе до достижения конечной концентрации 15 мг / мл. Фильтр стерилизуют через 0,2 мкм фильтр и хранить его в темном месте при комнатной температуре до двух месяцев.
2. Стерилизовать всех хирургических инструментов в автоклаве. Хирургической области следует продезинфицировать менее чем за один час до начала операции.
3. Запишите вес тела мыши, чтобы корректировать дозу бенгальским розовым, который будет введен. Мы вводили 10 мкл / г веса животного в женских мышей CD1 12 недель в настоящем протоколе. Количество Бенгальский Розовый необходимых для получения желаемого корковых размер повреждения могут быть легко определены в отдельный набор предварительных экспериментах путем тестирования различных дозах (обычно 2 мкл / г, 5 мкл / г или 10 мкл / г веса тела). Следует отметить, что количество Бенгальский Розовый который будет введен в большой степени зависит от условий эксперимента, в частности, тип источника светаиспользоваться и продолжительности воздействия света. В настоящем исследовании, 10 мкл / г (150 мкг / г) дозы было обнаружено, что необходимо для индукции фототромбоза при экспонировании свету в течение 15 мин, тогда как другие группы сообщили, что либо 50 мкг / г ^6,8 до 100 мкг / г ¹⁰ внутрибрюшинной инъекции было достаточно для индукции фототромботического поражения.

2. Анестезия процедуры

1. Обезболить мышей с изофлуран в прозрачной камере индукции (3,5-4% для индукции, 1,5-2% для поддержания) в 50% (объем / объем) oxygen/50% (об / об), закись азота газовой смеси. Газообразный наркоз позволяет быстро пробуждения из животных, и уровень анестезии газа может быть легко отрегулирована. Кроме того, мыши могут быть также анестезировали кетамин-ксилазином смеси.
2. При глубокой анестезии достигается, удалите наркозом животного из индукции камеры, поместите его в стереотаксической рамы и поддержание анестезии с использованием маски. Отрегулируйте isofluraNE дозы для достижения адекватного уровня анестезии. Мониторинг частоты дыхания в течение всей процедуры и убедиться, что она постоянна (40 - 60 вдохов в минуту).
3. Использование палец пинчи для того, чтобы обеспечить животное анестезировали глубоко.
4. Применение глазной мази, для того, чтобы предотвратить сухость глаз.
5. Осторожно вставьте ректальный зонд для контроля температуры в течение хирургических операций. Установите соответствующими ответными контролируемой грелку для поддержания температуры тела мыши при 37 ± 0,5 ° С.

3. Хирургия для освещения целевой области

1. Бритье головы мыши с электрической бритвой.
2. Надежно закрепите за голову и вставить в ухо баров внешнего слухового прохода. Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки.
3. Дезинфекции кожи на поверхности с переменным мазков из 70% этанола и бетадин использованием ватные тампоны.
4. Используйте скальпель, чтобы сделать надрез по средней линии от глаз LeVEL вниз к шее. Приложите кожу преднатяжителями держать черепа подвергаются.
5. Осторожно отвести надкостницей к краям черепа скальпелем и пусть поверхности черепа высушить с использованием стерильных ватных тампонов. Определить брегмы и лямбда. Поместите стакан микропипетки на темени, как опорная точка, затем переместить его в координаты вашего региона интереса. Интересующей области выбраны для этой статьи примерно резкой форме, сконцентрированные приблизительно 2 мм сбоку от темени, и площадью около 30 мм ^2, которая включает в себя большую часть сенсомоторной коры в соответствии с атлас мозга мыши Франклином и Paxinos ^11.
6. Отметьте положение интерес с ориентирами и положить оптического волокна в тесном контакте с поверхности черепа, чтобы избежать рассеяния света, но обратите внимание, чтобы не оказывать на него давление. Освещенной области может быть ограничено путем применения на череп маска с малой апертурой или колпачок на конце оптического волокна графического интерфейсаде.

4. Бенгальским розовым внедрения и активации

1. Загрузите решение Бенгальский Розовый в 1 мл шприц и рассчитать количество в виде инъекций в соответствии с дозой 10 мкл / г веса тела.
2. Перейдите к медленному внутрибрюшинного введения.
3. Пусть красителя диффузные и попадает в кровь. Через 5 мин включить Иллюминатор холодного света. Избегайте освещения животное любым другим источником света. Мы использовали волоконно-оптического осветителя 150 Вт интенсивности.
4. Через 15 мин освещения, стоп-экспозиции и сшивать раны. Через пять минут освещения уже производят миокарда и 10 мин, вероятно, достаточных для получения максимального эффекта ^12. Для того чтобы минимизировать изменчивость, мы решили осветить в течение 15 мин.

5. Шовный

1. Снимите кожу преднатяжителями и применять стерильный физиологический раствор, чтобы избежать обезвоживания.
2. Закрыть рану использованием Режущая NeedlЕ и шелковые или нейлоновые нити шва.
3. Прерывание обезболивание родов, осторожно удалите мышь от стереотаксический аппарат и положил его на предварительно нагретой грелку, пока она не полностью проснулся, а затем вернуть его в клетку. Температура тела следует тщательно контролировать во всех процедурах ограничить изменчивость в инфаркт расширения. В соответствии с концентрацией и путь введения, бенгальский розовый еще можно обнаружить в крови в течение нескольких часов после инъекции ^13. Предпочитаю отопления одеяло, чтобы потепление лампы, чтобы избежать возможных вторичных повреждений (бенгальским розовым длины волны поглощения находится в зеленой части спектра).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол будет производить корковое поражение, что уже видно на вскрытие коре невооруженным глазом (фиг.1А-1С). Фототромботического поражение развивается в поверхностных и глубоких слоях коры, в которой ткань является достаточно прозрачной, чтобы фото-активации бенгальс?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модификации и замены

Из-за своего пика поглощения при 562 нм, зеленый лазерный луч из отфильтрованного ксеноновой дуговой лампы был первоначально выбран для облучения фоточувствительных бенгальским розовым. Хотя лазер-опосредованного возбуждения еще использовался recently5...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made