Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения

Резюме

Опробование пробирке функцию β-клеток при помощи изолированных островков мыши Лангерганса является важным компонентом в изучении диабета патофизиологии и терапии. Хотя многие вниз по течению приложения доступны, этот протокол конкретно описывает измерение внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в качестве важного параметра, определяющего функцию β-клеток.

Аннотация

Неконтролируемое гликемии является отличительной чертой сахарного диабета и способствует заболеваемости, как нейропатия, нефропатия, и ретинопатии. В связи с ростом распространенности диабета, как иммуноопосредованной типа 1 и ожирением связаны типа 2, исследований, направленных на разграничении сахарный патофизиологии и терапевтические механизмы имеют решающее значение. В β-клетках панкреатических островках Лангерганса ответственны за соответствующим секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. В дополнение к глюкозе и других питательных веществ, то β-клетки также стимулируется конкретных гормонов, называемых инкретины, которые секретируются в кишечнике в ответ на прием пищи и действуют на β-клеточных рецепторов, которые увеличивают продукцию внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата ( цАМФ). Снижение функции β-клеток, масса и инкретин отзывчивость хорошо понимал внести свой вклад в патофизиологии диабета типа 2, и также все чаще связаны Wiй диабет типа 1. Настоящий изоляции островок мыши и протокол определения цАМФ может быть инструментом, чтобы помочь очертить механизмы, способствующие прогрессирования заболевания и терапевтические вмешательства, особенно те, которые опосредованы инкретин рецепторов или связанные рецепторы, которые действуют через модуляцию внутриклеточной продукции цАМФ. В то время как только измерения цАМФ будет описано ниже, описано протокол изоляции островок создает чистый препарат, который также позволяет для многих других последующих применений, в том числе глюкозы стимулировали секрецию инсулина, ^{[3H]-тимидина,} белок избытке, и экспрессии мРНК.

Введение

Строгое соблюдение эугликемии является необходимым условием предотвращения заболевания, такие как невропатия, нефропатия и ретинопатия, которые все признаки патологии неконтролируемого типа 1 и 2 диабета ^1. Снижение функции β-клеток и масса в обоих типов 1 и диабета 2 возмущают концентрации глюкозы в крови ^2. В то время как иммуноопосредованное типа 1 Результаты диабет от разрушительного потери инсулин-продуцирующие β-клеток, нарушение секреции инсулина β-клеток и периферической сигналов инсулина при диабете 2 типа вместе способствовать гипергликемии, дислипидемии, и увеличение производства печеночная глюкоза, которая в конечном итоге приводит к как потеря массы β-клеток и секреции инсулина мощностью от отдельных β-клеток ^3. Понимание основных механизмов β-клеток в прогрессировании типа 1 и диабета 2 мы надеемся привести к новым методам лечения для профилактики и лечения этих заболеваний.

В ти пробиркеSSUE модели культуры, такие как INS-1 и MIN6 увековечены β-клеточных линий, могут быть полезными инструментами для понимания специфические функции β-клеток. Однако взаимодействие между различными типами клеток внутри островка сами могут регулировать функцию β-клеток. Например, паракринная влияние глюкагона (выпущен из α-клеток) и соматостатин (освобожден от δ-клетками) в увеличение и уменьшение секреции инсулина, соответственно, демонстрирует важность близости клетка клеток в эндокринной ответ ^4. Кроме того, щелевые контакты между β-клеток усиливать высвобождение инсулина ^5. Кроме того, хотя успехи были достигнуты в создании инсулиномы линии, которые лучше воспроизведены физиологическую реакцию изолированных островков в глюкозу (например, INS-1, полученных 832/13 и 832/3 клеточных линий), их отзывчивость глюкозы еще отличается от обычной крысы островков ^6,7. Кроме того, реакция этих клональных линий клеток инсулиномына глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) агонисты могут значительно отличаться друг от друга, а также от нормальных островков ^6. Поэтому иммортализованные клеточные линии могут не представлять лучшую модель для опробования агенты, которые влияют на производство цАМФ.

В отличие от инсулиномы-клеточных линиях, изучая функцию β-клеток только в целых животных моделях предлагает свой набор осложнений. Один из самых больших проблем в работе с эндокринной ткани измерения точной концентрации гормона освобождены. В частности, печень играет важную роль метаболизме инсулина, и поток крови поджелудочной железы идет непосредственно в печень. Таким образом, измерение инсулина в плазме не может точно изобразить количество инсулина вырабатывается организмом из самого поджелудочной железы или влиянии различных методов лечения на скорость секреции инсулина ^8. Кроме того, метаболизм почек глюкагона может ограничить надежность выход глюкагона из островковых клеток ^α-9. Таким образом, выделение первичных островки мыши для экспериментов в пробирке обеспечивает более точное понимание того, как островок реагирует на специфические стимулы, чтобы дополнить измерения, сделанные в естественных условиях.

Настоящий протокол для выделения островков мыши является устоявшихся протокол, используемый ряда групп (с небольшими изменениями, которые могут помочь повысить успех) ^10,11. Кроме того, определение производства цАМФ обеспечивает прямой считывани инкретин отзывчивости на β-клетки. В сочетании с измерением цАМФ, содержание белка и секреции инсулина также может быть определена количественно с того же образца цАМФ преп, помогает определить, находится ли дефект в функции β-клеток проксимальный или дистальный к цАМФ ^10. Конечное содержание цАМФ и секреции инсулина приложение в этом протоколе может быть очень мощным инструментом для понимания влияния фармацевтических и пищевых компонентов, среди прочегос, на цАМФ и секреции инсулина. В дополнение к стимуляции только из глюкозы, другие соединения могут быть использованы для измерения изменений в цАМФ и секреции инсулина ^10,11.

Наконец, хотя инсулин является основным гормоном, мы анализа из изолированных островков, других гормонов, таких как глюкагон и соматостатин, а также цитокинов, эйкозаноидов и циклического аденозинмонофосфата, также может быть измерено, либо посредством переходного анализа стимуляции или количественного определения их уровни в культуральной среде ^12. Наконец, хотя за рамки этой рукописи, островок изоляции с описанным способом изоляции коллагеназы позволяет для сохранения островков так, что многие другие нижестоящие приложения могут осуществляться, например, трансплантации островков, выделения РНК для количественного ПЦР в реальном времени или микрочипов анализирует, белка изоляция для вестерн-блоттинга, островок вложения и изображения иммунофлуоресцентным и [3Н]-тимидина в качестве меры островковых клеток Repliкатион, некоторые из которых были описаны в предыдущих JOVE статей ^13-16. В целом, в соответствии с процедурой выделения островковых клеток, описанный в протоколе может обеспечить исследователя с важной и полезной информации для разработки методов лечения и содействия разработке лекарств, направленных на повышение функции β-клеток.

протокол

Все эксперименты на животных были выполнены в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Протокол демонстрируется была выполнена под руководством и утверждения уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) из Университета Висконсин-Мэдисон.

1. Приготовление растворов

1. Метод эвтаназии в этого протокола является обескровливание под Avertin анестезии (обзор альтернатив, см. Обсуждение). Чтобы AVERTIN, добавьте 0,625 г (1,25% или 44,2 мм) 2-2-2 tribromoethanol в 1,25 мл 2-метил-2-бутанола в 15 мл коническую пробирку и нагревают при 37 ° С в течение 20-30 мин. Vortex решение на высокой 10-15 сек, в то время, чтобы полностью растворить 2-2-2 tribromoethanol. После полного растворения, добавить решение в 48,75 мл дважды дистиллированной H ₂ O, фильтровать через фильтр 0,45 мкм в новый 50 мл коническую трубку, обернуть 50 мл коническиеаль трубка в алюминиевую фольгу и хранить при температуре 4 ° С на срок до одного месяца. Принесите трубку до комнатной температуры перед инъекцией мышам.
2. Чтобы Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS), составляют 1 L 1x HBSS с 10-кратным складе (Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) в дважды дистиллированной H ₂ O, добавить 0,35 г (4,2 ммоль) Начо ₃ и магазин при 4 ° С на срок до 1 месяца. Для каждой мыши, потребуется 105 мл этого раствора (плюс 5-10 мл дополнительных для пипетки ошибку) для изоляции островка.
3. Островки очень чувствительны к гипоксического повреждения; Поэтому, ССРХ пропускают с 95% O _2/5% СО _2, чтобы имитировать концентрации O ₂ в крови. Специальные смеси газа могут быть приобретены и пузырьков станция создана с помощью пипетки Пастера, прикрепленной к гибкому шлангу. После барботирования необходимое количество ССРХ с 95% O _2/5% CO ₂ в течение 15 мин, добавить 0,02% РИА класса BSA (бычий сывороточный альбумин) по объему и держать на льду для гemainder из изоляции островка.
4. Для приготовления Ficoll, взвесить 32,5 г Ficoll в 400 мл стакане, добавить 80 мл HBSS, и перемешивают при 500-700 оборотов в минуту в течение 30 мин. После растворения, заливают раствор Ficoll в 250 мл градуированный цилиндр и добавить HBSS до отметки 130 мл на градуированном цилиндре для создания 25% раствор Ficoll. Обложка начало мерный цилиндр с двумя порциями Parafilm ® M (Pechiney Упаковка из пластика компании, Chicago, IL) и энергично встряхивают несколько раз.
5. Для 23%, 20,5% и 11% раствора Ficoll, добавить 27,6, 24,6, и 13,2 мл 25% Ficoll, соответственно, в 50 мл конические пробирки. Затем довести каждое решение до в общей сложности 30 мл HBSS и хорошо встряхните, чтобы перемешать. Все четыре решения фиколл следует хранить при температуре 4 ° С и хороши для до 2 недель.
6. Коллагеназа решение, которое подходит для изоляции активных островки получают из коллагеназы, выделенной из Clostridium histolyticмкм (Материалы таблицу). Каждая партия должна быть проверена на эффективность фермента. Как правило, коллагеназа используется при 0,3-0,5 мг на мл HBSS. Используя концентрации фермента в этом диапазоне (обычно 3 различных концентрациях), определить качество и количество изолированных островков из подобранных по возрасту мышей или помета, чтобы установить концентрацию рабочего фермента.
7. После правильной концентрации определяется каждой мыши требуется 35 мл коллагеназы в HBSS в течение всего протокола изоляции. Вихревой коллагеназы в HBSS до растворения. Непосредственно перед началом операции, предварительно загрузить 5 мл шприц с раствором коллагеназы, поместите канюли, и удалить пузырьки воздуха, и выйти на лед, пока это необходимо.
8. Культура СМИ островок для O / N инкубации является дополнен RPMI 1640 СМИ. Для исходного раствора, растворите одну RPMI 1640 пакет (Gibco, Нью-Йорк) в 1 л бидистиллированной H ₂ O и добавить 1,19 г HEPES (5 мм) и 2 г Начо ₃ (24 мм). Отрегулируйте рН до 7,4,Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С в темноте.
9. Для дополненной информации, добавить 10% FBS и 100 IU/100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина, соответственно, на фондовом RPMI 1640. Если другой концентрации глюкозы желательно, глюкоза, свободной от RPMI 1640, могут быть использованы и определенной концентрации глюкозы могут быть добавлены.
10. Для складе Кребс звонка бикарбонатная (Кребс), добавьте следующие ингредиенты, чтобы дважды дистиллированной воде в следующих концентрациях: NaCl (118.41 мМ), KCl (4,69 ммоль), MgSO ₄ (1,18 ммоль), KH ₂ PO ₄ (1,18 мМ ), NACHO ₃ (25 мМ), HEPES (5 мМ), и CaCl ₂ (2,52 мМ) при рН 7,4. CaCl ₂ следует добавить последний, и этот раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 2 недель.
11. Чтобы рабочий запас Кребса, первый газ с 95% O _2/182 5% СО ₂ в течение 10-15 минут с пипетки Пастера при 37 ° С с последующим добавлением 0,5% класса РИА BSAпо объему. Далее, глюкоза будет добавлен в нужной концентрации для анализа ин витро.

2. Подготовка Инструменты

1. Немного тупой кончики 30 - и 27-G иглы, используя точильный камень закруглить острие. Положите 45 градусов изгиб в иглу около ¼ дюйма от наконечника с помощью плоскогубцев. Будьте осторожны, чтобы не выдавить слишком сильно, что закроет внутренний диаметр иглы.
2. Отрежьте 3/0 шелковой нитью нить в примерно длины 4-дюймовых, один для каждой мыши.
3. Накройте вскрытии микроскопом базу с полиэтиленовой пленкой и пленкой вниз.
4. Отрежьте несколько кусочков абсорбирующего скамейке бумаги, примерно 3 х 5 дюймов в размере, по крайней мере, 2 на мышь.

3. Подготовка мышь

1. Заполните 1 мл шприц с 1 мл Avertin.
2. Введите AVERTIN раствор внутрибрюшинно при температуре около 40 мкл / г веса тела.
3. После мыши нет лonger реагирует на хвост или задних пинчах ног, тщательно перенести его на вскрытии микроскопом рабочей станции.
4. С мышь в положении лежа на спине, а его голова перед дистально, спрей мышь с 70% водным раствором этанола. Обязательно используйте достаточное количество 70%-ного этанола, чтобы ограничить количество меха в открытой грудной полости.

4. Открытие грудной полости

1. Зажмите мех и кожу мыши между двумя задними ногами и сделать первоначальный разрез через эпидермис, дерму и основной мембраны.
2. В то время как все еще зажимая кожу и основную мембрану, сократить к передней конечности на обеих сторонах мышь заботясь, чтобы избежать сокращения любые внутренние органы.
3. Сложите кожу и мембраны клапан над грудной клетки и снимите мечевидного отростка, чтобы облегчить доступ к поджелудочной железе для инфляции.
4. Переориентировать мышь с головой перед проксимально и двигаться внутренние органы к правой стороне работы гоAtion выявить нисходящей аорты.
5. Если ткань кровь не должна быть собрана, нисходящей аорты могут быть сокращены, чтобы завершить euthanization. Окунитесь в избыток крови со скамейкой бумаги или Kimwipe для более легкого доступа к общего желчного протока.

5. Раздувание поджелудочной железы

1. С рассекает микроскопом, переместить в тонкий кишечник, поэтому общий желчный проток образует перпендикулярную линию с главой мыши.
2. Возьмите пинцет и понять тонкую кишку и найти сфинктера Одди (сфинктера ампулы) в конце общего желчного протока, который splays выходят на тонкий кишечник из желчного протока, образуя белый треугольник на розовом кишечника. После сфинктера Одди был расположен, занять # 5 Дюмон щипцы и сдвиньте наконечник под общий желчный проток как можно ближе к тонкой кишке, насколько это возможно, стараясь не проколоть канал.
3. После прокалывания через тонкую кишку и соединительной ткани, используютверхушка Дюмон щипцы понять шва и протяните ее под общий желчный проток. Галстук с общего желчного протока как можно ближе к сфинктера Одди, как это возможно, убедившись, что узел тугой, чтобы предотвратить утечку.
4. Возьмитесь оба конца нити и тянуть к хвосту, чтобы положить некоторую напряженность на общем желчном протоке. Использование свободной рукой, сделайте небольшой надрез с микро ножницами в общий желчный проток чуть выше последнего бифуркации в печень. Примечание: Важно не вырезано слишком близко к сфинктера Одди, так как это может привести к частичной инфляции поджелудочной железы и избежать проходящем через общий желчный проток, как он будет также привести к плохому инфляции.
5. Удерживая оба конца строки с общего желчного протока тугой, удалите шприц / канюли, которая была с предустановленной 5 мл раствора коллагеназы из ведра со льдом, установите вниз шприц и вставьте притупляются 30 G иглу в разрезе общий желчный проток, стараясь не проколоть через ваLL воздуховода. Если игла 30 G недостаточно широк для желчных протоков с образованием уплотнения вокруг, удалить его и заменить тупого 27 G иглы.
6. Удерживая иглу на месте, отпустите шва и поднять шприц 5 мл. Медленно нажать на поршень шприца. Примечание: Если игла была успешно введен в общий желчный проток, он будет расширяться.
7. Продолжайте нажимать на поршень медленно и выпускания в пульсирующее, пока первая часть поджелудочной железы не разбухает, а затем при осторожном постоянном давлении до поджелудочной железы больше не разбухает. Примечание: Большинство поджелудочная железа провести 3-5 мл, прежде чем начать протекать. Кроме того, успешное инфляция будет иметь равномерное распределение экзокринной ткани и часть поджелудочной железы в верхней части живота, будут завышены.
8. Удалите иглу из общего желчного протока и отправился в сторону.

6. Поджелудочная железа Удаление

1. Возьмите пинцет в одной руке и изогнутой ножницами вс другой стороны. Используя щипцы, понять тонкую кишку в сфинктера Одди. С ножницы закрыты, используйте подсказку в отдельной части поджелудочной железы из тонкой кишки.
2. Распространение ножницы на части, чтобы увеличить разрыв между тонкой кишки и поджелудочной железы.
3. Поместите "V" ножниц, где тонкая кишка и поджелудочная железа придают друг с другом на правой стороне зазора, который был только что сделал. Используя щипцы осторожно потяните в тонкий кишечник мимо ножницами, чтобы удалить поджелудочную железу.
4. Продолжайте работать вниз в тонкую кишку в розовом соединительной ткани. В этот момент подобрать тонкую кишку рядом, где он придает желудка и поджелудочной железы отрезать от остальной части тонкой кишки. Примечание: Будьте осторожны, не отрезать поджелудочную железу, как это может начать сдуваться.
5. Аккуратно захватите часть поджелудочной железы, прикрепленных к животу щипцами (плоские щипцы работать лучше). В то время как подтягивание мягко на поджелудочную железу, используйте кривуюг ножницы, чтобы отрезать прочь на связях между поджелудочной железы и желудка.
6. Найдите селезенки и удерживайте его с вышеуказанными поджелудочной железы щипцами. Возьмите изогнутые ножницы и отрезать связи между селезенки и поджелудочной железы.
7. Найти где поджелудочной железы крепится к толстой кишке. Возьмите толстую кишку пинцетом и использовать кончик ножниц, чтобы протыкать. Распространение ножницы друг от друга как раньше для создания разрыва между толстой кишки и поджелудочной железы.
8. Покажите толстой кишки щипцами: это приведет к поджелудочной железы отпадение, подвергая его точных соединений в толстой кишке. СНиП от остальных соединений.
9. Найти розовый соединительной ткани, прикрепленный к поджелудочной железы и тонкого кишечника и сократить как можно ближе к поджелудочной железы, как это возможно. Примечание: Если пирсинг поджелудочной железы является проблемой, рекомендуется сократить ближе к тонкой кишки, как соединительная ткань будут отфильтрованы на последующих этапах.
10. GРаб столько поджелудочной железы, как это возможно и поднимите ее осторожно. С изогнутыми ножницами, срезать оставшиеся связи между поджелудочной железы и грудной полости, чтобы полностью удалить поджелудочную железу. Примечание: поджелудочная железа все равно должны быть завышены, если удалить правильно.
11. Храните снятые поджелудочной железы в ~ 2,5 мл раствора коллагеназы в 50 мл коническую трубку на льду, пока все другие поджелудочная железа не были раздуты и удаляется для эксперимента.

7. Стиральная

1. Принять все изолированные поджелудочная железа и переместить их в отдельные 50 мл конические пробирки каждый из которых содержит 25 мл свежего раствора коллагеназы
2. Поместите 50 мл конические пробирки в вертикальном положении в 37 ° С дрожащей водяной бане, способный совершать колебания в 220-250 оборотов в минуту, с шейкере выключен.
3. Газа каждый 50 мл коническую трубку с 95% O _2/5% CO ₂ в течение 5 мин с пипетки Пастера.
4. Напомним каждую пробирку плотно и поставить боком в дрожащей водыванна под поверхностью воды. Встряхнуть в 220-250 оборотов в минуту в течение 20 сек, каждую минуту, до 16 мин, начиная с мин 6. (Встряхните в 6, 8, 10, 12, 14, и 16 мин)
5. Сразу передачи трубки в центрифуге при комнатной температуре в течение быстрого вращения. Принесите центрифугу до 1500 оборотов в минуту (400-500 г) и выключите немедленно.
6. С помощью вакуумного ловушку, аспирация около 22,5 мл раствора коллагеназы без нарушения гранул. Промыть 10 мл HBSS и вихря осторожно, чтобы разбить осадок.
7. Выполните еще один быстрый спин при комнатной температуре до 1500 оборотов в минуту (400-500 г).
8. Аспирируйте около 10 мл раствора, снова без нарушая гранул.
9. Промыть еще 10 мл охлажденного льдом HBSS и вихря осторожно, чтобы вновь разрушить осадок. Повторите быстрые спин и аспирата 10 мл раствора.
10. Аккуратно вихрь осадок в остальных 2,5 мл раствора HBSS. Налейте раствор через1,000 мкм меш в новый 50 мл коническую пробирку. Это позволит удалить крупного мусора ткани не усваивается коллагеназы.
11. Промыть старый 50 мл коническую трубку с 2,5 мл охлажденного льдом HBSS. Используйте пипетки Пастера полоскать стороны трубки тщательно перед передачей 2,5 мл HBSS через сетку в новые 50 мл коническую трубку.
12. Выполните еще один быстрый спин при комнатной температуре при 1500 оборотов в минуту (400-500 г) для осаждения ткани.
13. Аспирируйте все HBSS, наклоняя трубку к вакуумному ловушку. Примечание: Очень важно, чтобы не мешать гранул так как это приведет к потере островков. Если осадок свободно или начинает двигаться к вакуумной ловушки, остановить аспирационных решение и повторно осаждения ткани, а затем продолжить аспирации оставшийся раствор.
14. Как только все ССРХ был удален, добавить 4,8 мл 25% раствора Ficoll и вихря, чтобы разбить осадок.
15. Осторожно слой 2,4 мл 23% Ficoll раствор в верхней части 25% раствора Ficoll добавлением 23%-ного раствора Ficoll к стороне 50 мл коническую пробирку. Для обеспечения даже отводками, повернуть 50 мл коническую трубку при добавлении раствора Ficoll.
16. Повторите процесс наслоения 20,5%, а затем 11% фиколл решения. Примечание: Если 4 различных слоев нет, добавить HBSS до отметки 50 мл и инвертировать трубки 4-6 раз или до тех пор, градиент фиколл больше нет. Повторно осаждения ткани и повторите шаги 7.14-7.16.
17. Спин 50 мл коническую трубку при комнатной температуре в 1820 оборотов в минуту (800 г) в течение 15 мин.
18. Налейте все фиколла в свежем 50 мл коническую трубку, заботясь, чтобы оставить осадок экзокринной ткани позади. Добавить ледяной HBSS до отметки 50 мл и инвертировать трубки 4-6 раз смешать Ficoll и HBSS вместе.
19. Спин 50 мл коническую трубку при комнатной температуре в 1820 оборотов в минуту (800 г) в течение 5 мин.
20. Тщательно аспирата большую часть смеси ССРХ / Ficoll помощью вакуумного трар. Не беспокоить гранул, как это свободно и легко может быть атмосферный.
21. Возьмем пипетки Пастера и передавать гранул к одноразовому пробирку.

8. Выбор Islets

1. Добавить 5 мл собирание СМИ (то есть. Дополнен RPMI 1640 или Кребс звонка бикарбонат буфер) к одноразовому пробирку. Примечание: сбор массовой информации будут изменяться в зависимости от последующих применений.
2. Пусть островки оседают на дно пробирку в течение 5 мин. Передача их с помощью пипетки Пастера до 15 мм на 60 мм чашки Петри из полистирола. Примечание: Важно использовать чашку Петри, поскольку они не лечат, и предотвратит островки от присоединения к блюду.
3. В отдельном 15 мм на 60 мм полистирола чашки Петри, добавляют 5 мл мыши островок питательных сред (100 мл RPMI 1640 со СМИ, 10 мл инактивированной нагреванием FBS, 1 мл ручка / Strep; фильтр стерилизовать).
4. При содействии вскрытии микроскопом с backligВозможность HT, использовать P-20 пипетку, чтобы выбрать островки в чашку Петри, содержащую островок питательных сред, заботясь, чтобы избежать переноса Acinar ткани мусора. Когда подсветкой, островки появится коричневато-золотистый и их наружной мембраны может блестеть, а ацинарных ткани появится светло-серый и унылый. Если препарат островок содержит большое количество мусора, желательно, чтобы вручную выбирать островки дважды в свежую среду. Снижение загрязнения мусора будет ограничивать островок комков после инкубации в течение ночи. Добавление ДНКазу (3000 ед / мл) в буфер пищеварения также могут помочь ограничить островок слипания (JWJ, личные наблюдения). Примечание: Важно, чтобы подсчитать количество островков, выделенных для планирования последующих экспериментах.
5. Инкубировать островков O / N в инкубатор на 37 ° C с 5% CO _2.

9. ЦАМФ

1. Этикетка 1,7 мл микроцентрифужные пробирки, по одному для каждой параллельной анализа. Примечание: Анализы цАМФ должны иметь как минимум дюПредпочтительны plicates для каждого условия лечения, но больше повторов в лечении.
2. После наполнение газом Кребса звонка бикарбонатная в течение 15 мин с 95% O _2/5% СО ₂ с пипетки Пастера, добавить 0,5% BSA РИА класса и конечной концентрации глюкозы 1,7 мм (инкубация раствора). Затем добавьте 1 мл свеже загазованности Кребс каждому пробирке. Два мл Krebs требуется на пробирку для предварительной инкубации и времени лечения пунктов; однако рекомендуется подготовить не менее 5-10 мл дополнительно.
3. Вихревой островки в середине чашки Петри, и с помощью P-20 пипетки самостоятельно выбрать островки к новому 15 мм на 60 мм чашки Петри из полистирола, содержащего 5 мл предварительной инкубации раствора мыть глюкозы, содержащей культуральную среду из островков.
4. В комплект цАМФ используется GE Healthcare цАМФ Прямая BioTrak ОВОС. Prococol используется является модификацией, описанной в "внутриклеточного цАМФ измерurement с использованием процедуры, без ацетилирования EIA с новыми реагентами лизиса ", и был оптимизирован для использования с минимальным числом островков на пробирку, что позволит увеличить количество условий обработки и технических повторах. Использование Р-20 пипетки, передачу по меньшей мере 13 островков в каждую пробирку с шага 9.2, поддержание согласованности размер островков между трубками, с 1 мл преинкубация буфера. Примечание: Увеличение количества повторов является более выгодным, чем число островков в трубке. Тем не менее, если есть достаточно островки увеличить количество островков на пробирку равномерно, желательно, чтобы это сделать, до 25-50 островков на пробирку.
5. С крышки пробирке открытым, трансфер в инкубаторе 37 ° C, установленной на 5% CO ₂ и выдержать в течение 45 мин, чтобы нормализовать секрецию инсулина всех островков к базовому уровню.
6. В то время как образцы инкубации, подготовить процедуры (то есть 8 мм, 11,1 мм, 16,7 мМ глюкозы и т.д.) в газированной Кребса FRом шагу 9.2. в 15 мл конические пробирки, с 1 мл дополнительных к ответственности за любой пипетки ошибки. Добавить 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) до конечной концентрации 200 мкМ. IBMX является общим ингибитор фосфодиэстеразы, который блокирует деградацию цАМФ, что позволяет цАМФ накапливаться в клетке, как он производится. (Примечание:.. Это настоящий производство цАМФ См. раздел дискуссий на случаях, когда измерения производство цАМФ может быть нежелательным Если IBMX остается вне анализа, больше островки будут обязаны на пробирку для того, чтобы получить данные цАМФ в Линейный диапазон стандартной кривой).
7. После 45 мин предварительной инкубации, удалить микроцентрифужные пробирки из инкубатора, колпачок и широтно-вихря каждого образца (менее 0,5 с). Это перепутать инсулина градиент, который, скорее всего, был сгенерирован из-за островков быть сосредоточены в нижней части трубы. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не вихрь слишком строго, так как это может негативно сказаться на стабильности островок (Примечание: ограничентрубки с островков можно осторожно щелкнул или перевернутом если это не представляется возможным импульсно-вихрь мягко. Эти опции добавит время анализа, который необходимо учитывать при планировании эксперимента).
8. Передача каждого трубку к настольную центрифугу (РТ) и спина, пока островки не достигнете 10000 оборотов в минуту (7,000-7500 г) и затем выключите немедленно.
9. Использование P-1000 пипетку, чтобы удалить большую часть Кребса в каждой пробирке, оставляя приблизительно 10-15 мкл Кребса на островке гранул. Используйте Р-20 пипетку, чтобы удалить часть ближе Островок осадок. Если гранулы нарушается, пипетки Krebs обратно в трубу и повторного спина.
   (Примечание: Если экспериментатор находит его слишком трудно удалить все Кребс из островков гранул, не нарушая его, последний 10-15 мкл могут быть оставлены на и составили в общем объеме позже в протоколе.
10. Получение достаточного количества жидкого азота в изолированный контейнер для оснастки заморозить образцы после инкубации.
11. Возьмите образцы из инкубатора, шапка, вихрь быстро (менее 0,5 сек) спина микроцентрифужные пробирки в таблице центрифуге (RT) до 10000 оборотов в минуту (7,000-7500 г), а затем отключается сразу. Если инсулин или другой метаболит является желательным вниз по течению приложений, не использовать P-1000 пипетку, чтобы собрать аликвоты среды в пробирке и хранить при температуре -20 ° C до дальнейшего анализа. Если стимулирование носитель не собираются, она может быть отброшена.
    (Примечание: IBMX является сильным потенцирующее глюкозы стимулированной секреции инсулина (GSI), Таким образом, результаты GSIS полученные из цАМФ стимуляции среде может не совсем точно отражать истинный эффект конкретных процедур на GSIS, особенно если эти эффекты являются тонкими.).
12. Повторите шаг 9,9 удалить как можно больше стимуляции среду, насколько это возможно без нарушения островок осадок. Привязать заморозить островок гранул в жидком азоте когда-то меньше 10-15 мкл Кребс оставил на островок гранул. После того как всеобразцы не были замораживали, хранить при температуре -80 ° С до измерения цАМФ.
13. В день определения цАМФ, получения новых лизиса реагенты в соответствии с протоколом производителя. Добавить 200 мл Реактив для лизиса 1В к каждому пробирке и вихря на максимальной скорости в течение 30 сек. Пусть трубы сидеть на льду в течение 10 мин, встряхивая каждые 2 мин в течение 30 сек. (Примечание: Протокол рекомендует проведение микроскопический анализ с трипановым синим, чтобы обеспечить лизис клеток, но это не выполняется для островков).
14. Подготовьте стандарты работы и настроить планшет ОВОС точно как описано в протоколе производителя. После того, как ферментный субстрат был инкубировали с микропланшет в течение 30 мин, выполнить дополнительный шаг 1,0 М серной кислоты и определяют оптическую плотность лунок микропланшета при 450 нм с использованием микропланшет-ридера.
15. Циклические результаты AMP будут записаны как фмоль / хорошо. Это должно быть нормализованы к общему объему исходного образца (200 мкл + любойостаточная Кребс вышел на островках из шага 9.9). Далее, результаты могут либо быть нормализованы к общему числу островков, давая фмоль цАМФ производства / островок или образцы лизатов может быть подвергнут бицинхониновой кислоты (BCA) анализа белков нормализовать результаты для общего клеточного белка (давая фмоль / мкг белка) . Последний рекомендуется при островковых размеры несовместимы между образцами, и может быть суррогатом размера островков. Белок набор для анализа Пирс BCA была с успехом использоваться в этом протоколе, и требует всего 25 мл образца. Стандарты BSA должны быть готовы в лизисном реагента 1В из комплекта анализа цАМФ.

Результаты

Для обеспечения высокого выхода островок во время изоляции, хирургические методы, изложенные в протоколе должны быть внимательно следил. Хотя методы, представленные здесь будет определяться с учетом каждой лаборатории, есть несколько важных шагов, которые приведут к успешному изоляц...

Обсуждение

С распространением диабета прогнозам, влияют 7,7% населения земного шара, требование новых методов исследования важно, чтобы понимать и лечить диабет ^18. Настоящий изоляции Островка устоявшихся протокол, используемый для экспериментов в пробирке и был представлен ранее, с неб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG