Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий

Резюме

Мы описываем корреляционный метод микроскопии, что сочетает в себе высокую скорость 3D живых клеток свете флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и крио-электронной томографии. Показана возможность корреляционного метода динамического изображения, небольшие ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клетками-хозяевами HeLa.

Аннотация

Крио-электронной томографии (cryoET) позволяет 3D-визуализации клеточных структур на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием ^1. Тем не менее, прямой визуализации отдельных вирусных комплексов в их среде клетки-хозяина с cryoET ² является сложной задачей, в связи с нечастыми и динамичный характер проникновении вируса в клетку, особенно в случае ВИЧ-1. В то время как покадровой живых клеток изображений дало большое количество информации о многих аспектах жизненного цикла ВИЧ-1, ^3-7, разрешение предоставляемой живых клеток микроскопии ограничена (~ 200 нм). Наша работа была направлена ​​на разработку корреляционный метод, который позволяет прямой визуализации ранние события инфекции ВИЧ-1 путем объединения живых клеток флуоресцентной микроскопии свет, крио-флуоресцентной микроскопии и cryoET. Таким образом, живых клеток и крио-флуоресцентные сигналы могут быть использованы для точного направления выборки в cryoET. Кроме того, структурная информация, полученная из cryoET можно бэлектронной дополнена динамической функциональной данных, полученных через живые клеток изображений флуоресцентных помечены цели.

В этом видео статье мы подробно методы и протоколы для структурных исследований ВИЧ-1 и клетки-хозяина взаимодействий с использованием 3D корреляционного высокоскоростной живых клеток изображений с высоким разрешением cryoET структурного анализа. HeLa клетки, инфицированные ВИЧ-1 Частицы характеризуют первую помощью конфокальной живых клеток микроскопии и область, содержащую те же вирусные частицы затем анализировали на крио-электронной томографии для 3D структурные детали. Корреляции между двумя наборами данных изображений, оптических изображений и электронных изображений, была достигнута с помощью самодельного крио-флуоресценции световой микроскопии этапе. Подход здесь подробно будет ценен не только для изучения вирус-хозяин взаимодействий клетки, но и для более широкого применения в клеточной биологии, таких как сотовые сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов. </ P>

Введение

Крио-электронной томографии (cryoET) является мощным методом визуализации, которая позволяет трехмерные (3D) визуализации клеток и тканей и дает представление о родной организации органеллы и клеточные структуры на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием ^1. Тем не менее, по существу низкий контраст неокрашенных замороженных гидратированный образец, в сочетании с их чувствительность к облучению, делает его трудно обнаружить области, представляющие интерес внутри клетки, а затем выполнения наклона серии успешно без повреждения целевой области. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, корреляционный подход, который сочетает в себе световой и электронной микроскопии необходимо. Особенности подчеркивается флуоресцентное мечение определены и находятся с помощью флуоресцентной световой микроскопии, а затем их координаты передаются в электронном микроскопе на приобретение высоким разрешением 3D структурных данных. Это корреляционный метод помогает размещения целевыхREAS интереса решать. Из-за ограничений на толщину образца с cryoEM (<300 нм), в настоящее время только периферийных областей клетки подходят для 3D структурного анализа CryoET. Дальнейшее уменьшение толщины замороженных гидратированных образцов стекловидного секционирования по ⁸ или по крио-сфокусированного ионного пучка (FIB) ⁹ фрезерных бы расширить возможности корреляционного изображений.

Ранее корреляционного методов использовались в первую очередь для облегчения cryoET сбора данных для крупных и статические структуры ^10-13. В этих исследованиях, крио-туров были реализованы принять cryoEM сетей и помещается на любом прямой микроскоп или инвертированный микроскоп ^10,11,14. Хотя переключение сетей кажется довольно простым в своих проектах, существуют дополнительные этапы передачи для сетки EM, увеличивая вероятность того, что сетка может быть деформирована, поврежденные и загрязненные. Мы недавно продемонстрировал технический прогресс вкорреляционной микроскопии, которая позволяет нам непосредственно визуализировать динамические события, которые по своей природе трудно уловить, таких как ВИЧ-1 и взаимодействия клетка-хозяин на ранних стадиях инфекции ^15. Мы добились этого путем разработки и осуществления Cryo-световой микроскопии предметный столик, который адаптирует системы картриджа, чтобы минимизировать повреждение образца из-за сетки обработки, что облегчает корреляцию. Наш дизайн включает в себя интегрированный держатель картриджа образца, что позволяет как крио-свет и крио-электронной микроскопии должны быть выполнены последовательно, на том же держателе образца, без переноса образца, что позволило бы упростить корреляционного процесса. Кроме того, мы также внедрили точной и надежной корреляции процедуры с использованием флуоресцентных латексных как координатных меток.

протокол

1. Культура клеток HeLa на покрытые углеродом, золото EM Finder сети

1. Тлеющего разряда углерода стороне 200 меш R2 / 2 Quantifoil золото EM искатель сетки при 25 мА в течение 25 сек.
2. Пальто с сеткой EM фибронектин, путем размещения его, углерода стороной вниз, на 40 мкл капли 50 мкг / мл раствора фибронектина, то вылечить под УФ-светом в течение 2 часов в капюшоне культуры ткани.
3. Пластина HeLa клетки на сетку при плотности 2 × 10 ⁴ клеток / мл (всего 2 мл культуры) в стеклянным дном чашки для культивирования и роста клеток при 37 ° С с 5% СО _2, в DMEM дополнена 4,5 г / л L-глутамина и глюкоза, 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, в течение приблизительно 18 часов. HeLa клетки инфицируют после O / N культуре.

2. Инфекции ВИЧ-1 и Live-ячейки изображения

1. Добавить трекер флуоресцентные клетки (красный CMTPX, 1 мкл / 2 мл) в стакан дном культурыблюдо (с шагом 1.3) и инкубировать блюдо при 37 ° С в течение 10 мин, чтобы разрешить до-дубль флуоресцентным красителем.
2. Промыть клетки с PBS и добавляют 50 мкл предварительно нагретого свежей средой.
3. Место блюдо на живых клеток камере, при 37 ° С, из скользящего Поле конфокальной микроскопии сканера. Выбор нескольких полей (10-15 позиции), которые содержат 1-3 клеток / квадрат, с клетками двух фаз митоза, когда они наиболее размазанной и плоские (см. рис 2с и 2d), так cryoEM требует относительно тонких областей образца. Храните эти позиции для будущих томография (шаг 2.5).
4. Infect клеток с VSV-G псевдо-типизированных ВИЧ-1 частиц, содержащих GFP-Vpr (мы используем 40 мкл образца, содержащего 40 нг / мл р24). При добавлении вирусных частиц в нижнюю тарелку, быть осторожным, чтобы не мешать сетки Е.М., поскольку позиции для визуализации уже выбраны и сохранены.
5. Сразу после добавления вирионов, собирают тиМне покадровой высокоскоростной 3D конфокальной изображения, на ранее выбранной позиции (с шагом 2,3) в течение 20-40 мин.
6. Конфокальной изображения были получены с помощью MetaMorph и проанализированы автоматизированные 3D слежения за частицей единой динамики частиц Imaris использованием программного обеспечения (см. Рисунок 1). Так как мы корреляции между результатами динамического поведения дифракционной ВИЧ-1 частиц с сотовой ультраструктура, покадровой живых клеток изображений и 3D-слежение частицы имеют решающее значение для результатов. Однако для больших и статическую структуру, простой флуоресценции изображение (без живых клеток) будет достаточно для корреляционного анализа.

3. Frozen-гидратированных EM Подготовка образцов

Чтобы свести к минимуму задержку между коллекция последних конфокальной изображения и крио-фиксации образца, Vitrobot FEI (или другого устройства стеклования) должны быть инициированы и подготовлены для погружных замораживания во время сбора флуоресценции конфокальной живых клеток изображений.

1. Включите стеклованию устройство и установите ее климат температуры до 22 ° С, целевой влажности до 100%, промокательной время до 7 сек, а подождать и слить время 1 сек.
2. Поместите коробку сетки хранения в плунжере Дьюара и подготовить холодной жидкости этана. Установите Дьюара на стеклованию устройства.
3. Сразу после конфокальной живых клеток изображений (раздел 2), поместите культуры блюдо на охлажденную льдом медного блока и передать его на cryoEM комнате подготовки образца. Загрузите сетки EM на специализированных пинцет и быстро промокните от всех носителях, на сетке. Блоттинга делается вручную, с помощью фильтровальной бумаги, после чего 4 мкл 15 нм золотых шарик раствор смешан с 0,2 мкм флуоресцентные микросферы немедленно помещали на эту сетку. Золотым бисером используются в качестве координатных меток для помощи томографического сбора данных и выравнивание. Флуоресцентные микросферы используются для оказания помощи корреляции между флуоресцентным и cryoEM изображения (см. рис 2С-2F).
4. Загрузите пинцетом на стеклованию устройства и поручить устройство, чтобы уничтожить и окунуться замораживание в жидком этана ^16. Блоттинга параметры оптимизированы для достижения наилучшего результата являются: блот время 7 сек; блот смещение, 0; время слива, 1 сек, температура, 22 ° С и влажности 100%.
5. Передача замороженных гидратированных сетки cryoEM держатель для немедленной визуализации cryoET или жидким азотом сосуд Дьюара хранения для последующего использования.

4. Крио-флуоресценции световой микроскопии

Самодельный, крио-камеру флуоресценции образца и ступенчатая система (рис. 3), необходимых для выполнения шага 4.1-4.10. Подробные характеристики и описание сцены могут быть найдены в июне и соавт. ^15.

1. Заполнить самостоятельно под давлением жидким азотом сосуд Дьюара с жидким азотом, по крайней мере, 2 часа перед началом крио-флуоресценции световой микроскопией (см. рисунок 3а).
2. Установите самодельных крио-Fluorescence стадии образца ¹⁵ (рис. 3) на перевернутой флуоресцентного микроскопа света, таких как Olympus IX 71.
3. Подключите вход для жидкости азот крио-предметный столик к самостоятельно под давлением Дьюара и поместить жидкий азот защита от переполнения выход в соответствующий контейнер. Подключите линии сухого газообразного азота в рукаве находится над объективом удалите с объектива теплой и свободной от льда.
4. Разместите платформу медного блока (черная стрелка на рисунке 3b) в крио-камеру этапе для загрузки замороженных гидратированных образцов сетки. Охладить и заполнить меди палаты крио-сцене с жидким азотом через входную линию от самостоятельно под давлением заполнения Дьюара.
5. Когда крио-стадии достигает температуры жидкого азота (в ~ 4-6 мин), перенесите ящик для хранения сетки (с шагом 3,5) к крио-сцене.
6. Поместите замороженные гидратированных образцов сетки в картридж EM образца на медном блоке и клип гизбавиться на месте с помощью С-образного кольца (при использовании картриджа Polara микроскопом), или поместить предварительно охлажденный медное кольцо сверху (черная стрелка на рисунке 3d), чтобы держать сетки на месте, а также для облегчения поиска сетки после крио-флуоресценции (если для не-Polara крио-электронной микроскопии).
7. Поместите картридж (с шагом 4,6) во внутренней камере крио-стадии (белый стрелкой на рисунке 3б).
8. Ищите и находите тех же частиц вируса из живых клеток данных изображений. Поскольку грид EM имеет индекс, это просто для локализации и той же частицы на сетке в обоих живых клеток изображений и крио-цветения изображений.
9. Приобретать крио-DIC и GFP изображений определены позиции под крио-состояние с помощью светового микроскопа с долгим сроком (2.7-4 мм) объективом. Во время крио-флуоресценции, периодически проверять уровень жидкости азота в крио-сцене и пополнить его, по мере необходимости, оставить этот пример этапе ниже -170° C.
10. По завершении крио-флуоресценции, осторожно вернуть образец картридж с платформой блок меди и хранения картриджа в жидком азоте Дьюара для будущего анализа cryoET с системой Polara. Если используется не Polara крио-электронной микроскопии, удаляйте медные кольца, получения этих образцов сетки, поместите его в ящик для хранения сетки, и хранить образец в сосуд Дьюара жидким азотом до образца не рассматривается cryoET.
11. Для анализа данных, перекрывают приобрел крио-DIC и GFP изображений (с шагом 4,9 см. 4б) и коррелирует позиции GFP сигналы в крио-флуоресценции изображение с результатами, полученными в живых клеток изображений серии.

5. Крио-электронной томографии

1. Загрузить образец картридж в крио-передаточную станцию ​​электронного микроскопа оснащен пушкой полевой эмиссией, такие как микроскоп Polara G2.
2. При низких доз режим поиска при увеличении 140X, идеntify и сохранить соответствующие квадраты сетки (с шагом 4.11) в стадию файла.
3. При низких доз режим поиска при увеличении 3500 X, вставьте 100 мкм апертуры объектива, поиск и сохранить все позиции коррелирует с сигналами GFP во второй файл этапе.
4. В условиях низкой дозы режим экспозиции, найти пустую область регулировать интенсивность пучка дозе 1 или 2 e ^- / ² результаты наклон оси вращения, с помощью функции этапе у, способны сжигать лед в неважных регионе углерода с несколькими золотым бисером.
5. В условиях низкой дозы режима фокусировки, отрегулировать фокусное расстояние до ~ 3 мкм и отрегулируйте угол, чтобы выровнять направление фокуса быть параллельны оси наклона.
6. В условиях низкой дозы режиме поиска вызывать сохраненные позиции (с шагом 5,3), регулировать высоту образца eucentric и проверьте диапазон наклона для области интереса. Приобретать проецирования изображения с очень низкими дозами электронов (~ 1 e ^- / ²⁾ от 8 до 10 мкм расфокусировки, в выставкахЮр режиме, для подтверждения коррелированных частиц вируса для крио-электронной томографии.
7. Переключитесь на низкодозной режима фокусировки. В ПЭМ меню автоматической функции, предшествуют автоматизированная eucentric высоты и сосредоточить функции на зоне фокусировки.
8. Установите параметры для получения наклона серии. Для рисунке 4 в этой бумаге, углы наклона в пределах ± 70 °, ниже и выше 45 °, на 3 ° и 2 ° наклон шагом, соответственно, были использованы, с 6 мкм расфокусировки и примерно 70 E ^- / ² общей дозы.
9. Повторите шаги 5.7 и 5.8 для всех сохраненных позиций. Пакетный томографии программное обеспечение может использоваться для автоматического сбора данных на несколько позиций для увеличения пропускной способности.

6. Трехмерная реконструкция использованием УПМ ¹⁷

1. Проверьте сырой серии наклона для регулировки минимального и максимального значений плотности и определить, есть ли целью исключить из-за большого сдвига изображения.
2. Начать eTomo и настройка панели с помощью томограммы типа оси, размер пикселя, доверительное диаметра, и т.д.. Затем создайте COM скрипты.
3. Настройка главного окна так, что несколько этапов томограммы вычислений можно регулировать / последующей одновременно. Измените необходимые параметры и выполнить конкретные программы, необходимые для каждого шага обработки (См. eTomo учебнике, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. На заключительном этапе, создать полный стек выровнен (со средней остаточной ошибки менее 0,6) и реконструкции томограмм с использованием взвешенного обратного проецирования алгоритма в УПМ.
5. Удаляет малые потенциальных областей, представляющих интерес использованием 3D нелинейной анизотропной диффузии выделения контуров программа реализована в УПМ с соответствующими параметрами для повышения контрастности и ясности.

Результаты

Чтобы охарактеризовать динамическое поведение вирусные частицы, HeLa, клетки, инфицированные ВИЧ-1, были обследованы на высокоскоростных конфокальной живых клеток микроскопии и движения частиц были проанализированы автоматизированных 3D отслеживания частицы (Рис. 1). Чтобы изб?...

Обсуждение

Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передовых корреляционный подход для анализа динамических событий с помощью сотовой покадровой конфокальной, живых клеток флуоресценции последующим cryoET. Наши методологических разработок соотнести 3D Live-ячейки изображения с выс...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.