Изменения Гетеротопическая Свиной задних конечностей Пересадка Модель для трансляционных васкуляризированных Composite аллотрансплантации (VCA) научно-исследовательского

Резюме

Васкуляризированных Композитный Allotransplantations (VCA) стали клиническая реальность. Тем не менее, широкое клиническое применение СВУ ограничивается хронической иммуносупрессии множественной лекарственной устойчивостью. Авторы представляют надежную и воспроизводимую большой животной модели для перевода новых иммуномодулирующих стратегии, которые могут свести к минимуму или потенциально устраняют необходимость иммуносупрессии в СВУ.

Аннотация

Васкуляризированных Композитный Аллотрансплантация (VCA), такие как кисти и лица трансплантации представляют собой жизнеспособный вариант лечения для комплексной опорно-двигательного травмы и разрушительных потерь ткани. Несмотря на благоприятные и очень обнадеживающие рано и промежуточных функциональных исходов, отказ от высокую иммуногенность компонента кожи в СВУ и возможных неблагоприятных последствий хронического иммуносупрессии множественной лекарственной продолжают препятствовать широкое клиническое применение СВУ. Таким образом, исследование в этой новой области необходимо сосредоточить внимание на поступательных исследований, связанных с уникальными иммунологических характеристик VCA и разрабатывать новые иммуномодулирующие стратегии для иммуномодуляции и индукции толерантности следующие VCA без необходимости долгосрочного иммуносупрессии.

В этой статье описывается надежную и воспроизводимую поступательное большой животную модель СВУ, который состоит из osteomyocutaneous лоскута в МНС определенной свиного гетеротопическая задних конечностей аллотрансплантации. Бриefly, хорошо васкуляризации кожную подушку идентифицируется в регионе переднемедиальной бедра с помощью ближней инфракрасной лазерной ангиографию. Основные мышцы, коленного сустава, дистального отдела бедренной кости и проксимального голени собирают на бедренной сосудистой ножке. Это аллотрансплантата можно рассматривать и VCA и васкуляризированной трансплантации костного мозга с его уникальными иммунопривилегированных особенностей. Трансплантат пересаживается к подкожной брюшной карман в животного-реципиента с компонентом кожи выводили на дорсолатеральной регионе для иммунной мониторинга.

Три хирургические бригады работают одновременно в хорошо скоординированным образом, чтобы уменьшить анестезии и время ишемии, повышая таким образом эффективность этой модели и снижения потенциальных вмешивающимся фактором в экспериментальных протоколов. Эта модель служит основу для будущих терапевтических стратегий, направленных на снижение и, возможно, устраняя необходимость в хронической иммуносупрессии множественной лекарственной в СВУ.

Введение

Васкуляризированных Композитный Аллотрансплантация (VCA), такие как кисти и лица трансплантации теперь клинический реальность с многочисленными рук и лица трансплантаций по всему миру ^12. Несмотря на то, что ранние и промежуточные результаты являются удовлетворительными и очень поощряя ^2, требование хронической лекарственной иммуносупрессии продолжает ограничивать его широкое клиническое применение. Достижения в мышиных моделях СВУ в том числе супер-микрохирургических анастомозов и nonsuture методов манжеты ^{13, 3} проложили путь к лучшему пониманию аллоиммунная ответов в СВУ. Мириады иммуномодулирующих протоколов были предложены для клинического применения на основе проведенного нами лучшего понимания иммунных механизмов в СВУ, но они должны быть подтверждено в большом животной модели, которая была бы достаточно прогнозировать их работы у людей ^7. На основе физиологических и иммунологических сходства между системами органов человека и свиней ^{6, свиней модели VCA можно считать надежные и экономически эффективные альтернативы для собачьей 9 и нечеловеческие приматы модели 1.}

В данной статье приводится подробный обзор методологии, используемой в нашей МНС определенной свиного гетеротопической задних конечностей модели трансплантации, которая служит основу для наших нынешних и будущих иммуномодулирующих стратегий, направленных на индукции иммунной толерантности к СВУ и, следовательно, расширяет свой клиническое применение. Мы используем хорошо характеризующиеся инбредные свиней разводят в гомозиготности в свиной лейкоцитов антигена локуса специально для их использования в трансплантации исследований, связанных с ^11. Мы поднять васкуляризованной osteomyocutaneous лоскут на основе бедренных сосудов. Лоскут содержит нетронутыми васкуляризованной костный мозг в дистального отдела бедренной кости и проксимального отдела большеберцовой кости. Переднемедиальной кожи бедра также входит в трансплантата и выводили наружу в дорсолатеральной аспекте животного-реципиента иммунного мониторинга наиболее иммуногенным компонента Oе VCA. Дорсолатеральной позиционирования облегчает клиническое обследование в стоя и сидя позиции и также держит аллотрансплантата кожу относительно чистый.

Ustener др.. Представил один из первых крупных животных моделях трансляционных в СВУ по пересадке радиальные передних конечностей osteomyocutaneous закрылки в беспородных сельскохозяйственных свиней ^15. Группа использовали эту модель, чтобы продемонстрировать в первый раз, что острое отторжение в СВУ которая включала очень иммуногенный компонент кожи может быть отложено и обрабатывают клинически значимых стратегии без значительных осложнений лекарственной конкретных и побочных эффектов. Благоприятные результаты, полученные в этом исследовании, впоследствии построили основополагающий шаг в разработке схемы лечения для реконструктивной трансплантации человеческого. Хотя эти модели рано свинья VCA были хорошо подходит для разработки протоколов для предотвращения отторжения кожи, мышц, костей, нервов и сосудов у них не было специализированных структур, таких как суставного cartilagе и синовиальной мембраны суставов. Последующие усилия были сосредоточены на том числе медиальной цифры животного, что потребовало полнометражный размещение литой для предотвращения трансплантата схода ^14. Хотя подходит для расследования отказ от всех основных компонентов трансплантации конечностей, одним из основных ограничений этой модели было после трансплантации амбулаторно трудности из-за бросить размещение. Таким образом, гетеротопные свиней модели конечностей Аллотрансплантация, состоящий из большой берцовой кости, фибула, коленный сустав, дистального отдела бедренной кости, окружающие мышцы, и весло кожи, были созданы, чтобы, прежде всего, изучить иммунологические аспекты СВУ, позволяя животному свободно передвигаться после операции с минимальным morbidit ⁸ .

Развитие хорошо охарактеризованных SLA определенных инбредных свиней через пионерской работе д-р Дэвид Х. Sachs привело к новой эре трансляционных исследований СВУ. Используя гетеротопической задних конечностей модель трансплантации в незначительных обстановке антиген рассогласования, МатемГЭС и др.. ¹⁰ показали неопределенный выживание опорно-двигательного аппарата компонентов с короткого курса циклоспорина лечения. Выживание компонент кожи, однако, был только продлен по сравнению с никем не контролируется лечения. Потеря компонента кожи трансплантата было связано с изолированной и очень энергичной иммунного ответа, в частности, на эпидермис. Аналогично, используя в полной мере несоответствие свиней с истощением Т-клеток, короткого курса циклоспорина и цитокинов мобилизованы доноров мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных терпимости только опорно-двигательного аппарата компонентов и компонента кожи по-прежнему отклонил ^5. Это явление, называемое "разбить толерантность", принес парадигмы в исследовании СВУ с большим акцентом на высокую иммуногенность компонента кожи, который является неотъемлемой частью большинства реконструктивных трансплантаций на сегодняшний день.

В этом модифицированной модели, мы используем конца в конец анастомоза по ligatinг получатель бедренная артерия и вращая его краниально (рис. 1). Это не только снижает время ишемии, позволяя использование обычного соединительного устройства, но также снижает вероятность отказа анастомоза. Мы не наблюдали никаких ишемических событий следующие перевязки бедренной артерии в наших получателей, указывая, что коллатеральное кровообращение было достаточно, чтобы обеспечить кровоснабжение к родному ногу. Кроме того, в этом модифицированном методе вовне компонент кожи мобилизованы на основе базовых перфораторных сосудов и расположена в поперечном направлении (рис. 1) в отличие от вентральной позиции паха в традиционной модели ^10. Это позволяет легко визуализировать трансплантата для иммунной мониторинга в положении стоя или сидя животного.

Таким образом, надежные и воспроизводимые большая модель животное имеет важное значение для расследования стратегии индукции толерантности к компоненту кожи СВУ и разработать новый пoninvasive иммунные стратегии мониторинга для лучшего прогнозирования выживания трансплантата.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В этом видео-публикации, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной уходу и использованию животных комитета университета Джонса Хопкинса институционального (IACUC) на.

1. Предоперационное планирование

1. Мы используем MHC-определяется MGH кроверодственной миниатюрный свиней (15-20 кг) в наших трансляционных исследований для конечностей аллотрансплантации котором один мужчина донор предоставляет конечности для двух женщин, получающих (рис. 1). До операции, доноров и получателей животные подвергаются тщательной клинической оценки ветеринаром.
2. В целях минимизации анестезии и время ишемии, доноров и получателей процедуры проводятся одновременно на трех операционных столов в одном посвященном большой операционной животных. Работа в команде и координация между хирургическими бригадами, а также ветеринарного персонала имеют решающее значение для общего успеха этой процедуры. Хирургическая план обсуждается с ветеринарной команды в официальном заседании 1-2 Недели до дня операции.
3. Туннелируется центральный венозный катетер (7 Fr двойной просвет Хикман катетер) помещен во внешнее или внутренней яремной вены каждого животного-реципиента до пересадки на иммуносупрессивной контроля уровня наркотиков и внутривенного введения иммуносупрессивных и / или иммуномодулирующих препаратов. Эти катетеры находятся под контролем зрения через венозной урезанной техники и тоннельного кзади от выхода высоко на шее спинной и крепится с помощью мононити невсасывающихся швов и клеевой повязка обернуть вокруг шеи.
4. Держать животных НПО (не твердую пищу, но разрешается воды экспромтом) по крайней мере 12 ч до операции.
5. В день операции, степенный животных с кетамин 20 мг / кг и ксилазина 2 мг / кг внутримышечно.
6. Наведите соответствующего размера эндотрахеальной трубки и подключите его к анестезии машины и вентилятора (поддерживается на изофлурана 0,5-3%)
7. Наведите внутривенный катетер в краевую ушную вену и администрированиявес на основе 0,9% физиологического раствора в течение всей процедуры.
8. Администрирование преимущественное обезболивание (бупренорфин 0,02 мг / кг внутривенно).
9. Администрирование профилактическое антибиотик (цефазолин 20-25 мг / кг IV) до первоначального разреза как к донора и реципиента животных.
10. Используйте стерильной техники во всех процедурах обеих получателями и донорами. Это включает в себя использование автоклавного или газ стерилизованных инструментов, масок, головных шапки, стерильные хирургические халаты и стерильные перчатки. Бритье площадь разреза с клипера и дезинфицировать с чередующимися решение Betadine и алкоголь.

Интраоперационная Мониторинг:

1. После индукции и интубации, поддержания анестезии, с ингаляционной смеси 0,5-3% изофлураном в кислороде.
2. Монитор сердечного ритма, пульсоксиметрии, ЭКГ, в конце выдоха CO ₂ и ректальной температуры непрерывно и записывать каждые 15 мин.
3. Предотвратить переохлаждение с Баир Hugger теплой приточно-одеяло.

Osteomyocutaneous Limb аллотрансплантата Harvest от доноров Свиньи:

1. Поместите доноров животное в лежачем положении на операционном столе и драпировка в стерильных условиях.
2. Используйте почти лазерного излучения инфракрасного диапазона ангиографии для выявления Перфоратор сосуды переднемедиальной кожи. Введите Индоцианиновая зеленые на примерно 0,06 мг / кг разведенных в 2-5 мл физиологического раствора через периферических сосудов доступа. Примерно 10 сек позже, выполните 30 сек-2 мин от ближней инфракрасной записей. Используйте видео из этих записей, чтобы определить перфораторы. На основе перфораторов, пометить участок кожи (примерно 100 см ²⁾ для мониторинга.
3. Используйте скальпель, чтобы сделать паха разрез кожи в непрерывности с маркировки для кожной (рис. 2).
4. Определить бедренных сосудов и изолировать их дистальнее уровне suprageniculate филиалов и проксимально до уровня паховой связки.
5. Проанализируйте кожу и подкожные ткани в то время как preservinг площадь кожной. Шовный края кожи, чтобы основные мышцы, чтобы избежать сокращения во время сбора урожая закрылков.
6. Выполнение остеотомии чуть выше лапки с помощью сабельная пила (электрический привод ручки, Synthes, West Chester PA).
7. Разделите мышцы проксимальных бедра с помощью электрокоагуляции.
8. Разделите бедра в середине вала, оставляя osteomyocutaneous лоскут на сосудистой ножке. Лоскут содержит весло кожи, лежащие в основе мышц бедра, коленного сустава, дистального отдела бедренной кости и проксимального отдела большеберцовой кости, который включает нетронутыми васкуляризованной костный мозг с его уникальными иммунологических особенностей.
9. Использование костной воск для достижения гемостаза в пространствах мозга. Гладкая костного края с помощью ronjeurs в рамках подготовки к получателю.
10. Держите трансплантат перфузии на его сосудистой ножки до бедренных сосудов у получателя не готовы (рис. 3).
11. После вскрытия получатель будет завершена, перевязывать доноров бедренных сосудов проксимального возможно болеей влить трансплантата с гистидин-триптофан-КГ (HTK, Кустодиол, Ньютаун ПА) до трансплантации.
    Примечание: донор конечностей пересаживают на противоположной стороне получателя т.е. левой конечности доноров на правой стороне получателя и правой конечности доноров на левой стороне получателя).
12. Эвтаназии доноров свинью сразу же после уборки второй задних конечностей с использованием 100 мг / кг пентобарбитала натрия IV. Смерть подтверждается ветеринарной персонала на установленным протоколом.

4. Процедура Получатель (задняя конечность Аллотрансплантация)

1. Начните индукцию получателя и интубации сразу после первоначального донора разрез, чтобы позволить подготовку судов получателей в то время как донор конечностей в настоящее время собирают. Это позволяет избежать лишних время ожидания и сокращает общее время анестезии для донора и реципиентов.
2. Расположите животных на спине с 30 ° вращения на операционной стороны в Аллож воздействие дорсолатеральной стороне.
3. Сделайте паха разрез и разоблачить бедренных сосудов; изолировать их дистальнее уровне suprageniculate филиалов и проксимально до уровня паховой связки.
4. Создать подкожный карман от паха к дорсолатеральной брюшной стенки для привитого вставкой (рис. 4).
5. Лигируют донорских сосуды и промойте трансплантата с HTK.
6. Выполните трансплантата вставку в перевернутом образом: А весло кожи перед дорсолатеральной чтобы легко иммунную мониторинг в положении стоя и нарезанные концы бедренных сосудов, стоящих каудально, чтобы из конца в конец сосудистых анастомозов без всякого напряжения на судах ( Рисунок 5).
7. Если возможно, используйте сосудистый сцепного устройства (Synovis, St Paul MN) для венозных анастомозов (размер 2,5-3,5 подходит для 10-20 кг животных). Это значительно сокращает время ишемии по сравнению с обычными методами.
8. Выполните артериальное anastomoses использованием традиционной технологии шовный с 9-0 шва (Synovis, St Paul MN)
9. После сосудистой проходимости подтверждается, закрепите трансплантата в месте с 3-0 PDS швов (рис. 5). Мышцы трансплантата пришивается к мышц брюшной стенки. Привитые мышцы не должны быть пришиты к мышц бедра получателей, так как он может быть вредным при движении животных вокруг клетки.
10. Экстериоризироваться весло кожи на дорсолатеральной стороне для иммунной мониторинга (рис. 6) и сшить его на соседнюю кожу с помощью 3-0 викрил подкожные швы и 4-0 мононити рассасывающиеся узловыми швами кожи.
11. Закройте кожу паха в слоях с использованием 3-0 викрил подкожные швы и 4-0 мононити рассасывающиеся узловыми швами кожи.
12. Поместите 50-100 мкг / ч фентанил патч для послеоперационного обезболивания.
13. После пересадки задних конечностей аллотрансплантата, вернуть животное к его пера, как только проснулся и комфортно дыхание само по себе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Двадцать четыре SLA определенные свиней гетеротопные пересадки задних конечностей были выполнены с помощью нашего модифицированный метод со средним ишемии время 78 мин (диапазон: 62-94 мин). Прививка вставки и дорсолатеральный кожную подушку позиционирования были достигнуты без труда у в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Исторически сложилось, что гетеротопическая протокол задние трансплантации конечностей включены экстериоризации веслом кожи до брюшной стенки живота и сосуды были анастомозировали в манере конца в сторону (Hettiarachty 2004). Однако, на наш модифицированного метода, перевернутая лоскут insetti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B