Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах

Резюме

Мы измеряли напряжение выпуска в аксон, который был частично поврежденных с помощью лазера рассекатель одновременное измерение силовой спектроскопии проводили на оптически-ловушки зонд приклеен к мембране аксона. Разработанный экспериментальный протокол оценивает аксон адгезию к культуральной подложки.

Аннотация

Формирование функциональных соединений в разработке нейронной сети зависит от внешних сигналов. Нейрита роста развивающихся нейронов подлежит химической и механической сигналов и механизмы, с помощью которых он чувствует и реагирует на механические сигналы плохо изучены. Выяснения роли силы в камере созревания позволит конструкции каркасов, которые могут способствовать клеточной адгезии и цитоскелета связи с подложкой, и, следовательно, улучшить способность различных типов нейронов к регенерации после травмы.

Здесь мы опишем метод применять одновременные измерения силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Мы измеряем снимающее напряжение в частично поврежденных аксонов одновременным интерферометрическом отслеживания оптической ловушке зонда придерживался мембране аксона. Наш экспериментальный протокол определяет снимающее напряжение с чувствительностью piconewton и динамика ослабления натяжения намиллисекунду временным разрешением. Поэтому оно предлагает высокое разрешение способ изучить, как механическая связь между клетками и субстраты могут быть модулированы по фармакологическому лечению и / или различные механические свойства подложки.

Введение

Оптическая микроскопия является одним из менее инвазивных система визуализации доступны для наблюдения живых клеток. С эксплуатацией эффекты, такие как давление излучения (как в оптических пинцетов ^1), или высокой энергии потока фотонов (как в лазерных диссекторе ^2), эта технология была распространена на нано-манипуляции. Оптической системы дает точного контроля для визуализации и управления суб клеточных мишеней ^3. В то же время, благодаря точной калибровки поставляемых мощности лазера и оптических инструментов достижения мягкой или инвазивные манипуляции образца с беспрецедентной воспроизводимости.

Несколько лабораторий интегрированы в той же экспериментальной установке, оптических пинцетов и лазерной рассекатель для того, чтобы удалять органелл ^4, соединить вместе различные ячейки ^5, или стимулировать клетки оптически приводом грузов ^6,7. В то время как оптический пинцет, после калибровки оптического жесткость, позволяютконтроль приложенной силы к ячейке по шкале piconewton, лазерных систем вскрытия может модулировать оптическое манипулирование, которое колеблется от мембраны фото-порации абляции одной органеллы или рассечение субклеточных структур. Однако, лазерное рассечение калибровки опирается на качественную оценку субъекта оптическое манипулирование по отношению к энергии, подводимой к образцу, в основном на основе анализа изображений иллюстрирующие морфологические изменения, вызванные к образцу ^8. В предложенном методе, мы покажем, как выполнить силовой спектроскопии измерения в течение лазерного рассечения аксональное развивающихся нейронов, в количественном выражении, по шкале piconewton, сила, создаваемая измененное равновесие в структуре цитоскелета субклеточном камеры ^9. Искусственный нейронов прилипать к подложке, и поляризации в процессе разработки. Поляризации фазы происходит в течение первых пяти дней в пробирке. На втором этапе поляризации, одна из extrudния нейритов становится больше, и она будет дифференцироваться, чтобы стать аксона ^10. Удлинение аксонов в ответ на силу буксировки на конус роста ранее моделируется модель Dennerl ^11. В последнее время эта модель была расширена, чтобы включить ¹² роль нейритов адгезию к внеклеточной матричных субстратов. Это биофизические модели, предложен после экспериментальных наблюдений ^13, показал, что тяговое усилие на конус роста, распространяющихся вдоль аксонов, которые модулируются фокальные адгезии к подложке. Кроме того, поражение аксональное производит местный снятие напряжения, продвигаясь к телу клетки. Таким образом, мы предположили, что такие измерения напряженности выпустили в месте, вдоль аксона между поражением и клетка сома дает возможность оценить увлажняющего результат влияет фокальные адгезии.

Мы калибровку необходимой энергией фотонов потока лазерного диссекторе контролировать степень нанесенного аксональное повреждающихе, от полной перерезки частичного поражения. После калибровки, мы повторили частичного поражения в аксонах несколько дифференциации нейронов и разработали протокол для количественной оценки напряжения выпуска, и полученные таким образом количественный параметр для оценки адгезии аксон к подложке ^14.

В настоящей работе мы подробно разработанный протокол, который представляет собой точную экспериментальную методику для оценки и сравнения с чувствительностью piconewton аксонов адгезию к подложке в различных экспериментальных условиях, таких как химическая обработка ^14, или различные типы клеточных поддержки культуры.

протокол

1. Оптическая схема

Вся оптическая система была описана ранее ^15. Кратко, оптическая система пинцетом основана на иттербия непрерывной волны (CW) операционной волоконным лазером на длине волны 1064 нм (IPG Laser GmbH). Пространственный модулятор света (ПМС) (LCOS-SLM, модель X10468-07 - Hamamatsu) изменяется фаза входящих ИК лазерный луч для управления положением захвата точка фокусировки на чашку для культивирования при компьютером голограммы. Свободном доступе Blue-пинцет программного обеспечения (веб-ссылка на оборудовании таблицу) синтезированных голограмм проецируется на пространственный модулятор света. Интерферометр для измерения силовой спектроскопии была основана на четырехквадрантные фотодиод (QPD, S5980 с 6041 C5460SPL доске - Хамамацу) и фотодиод (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

Лазерный источник рассечение было импульсным субнаносекундном УФ Nd: YAG лазера на длине волны 355 нм (ПНВ-001525-040, Powerchip нано-Pulse УФ лазер - Teem Photonics). Акусто-модулятор (MQ110-A3-УФ, 355 нм плавленый кварц-AA-Оптико-электронные), контролируемые мощности УФ лазерной переданной образцу.

Голографического оптического пинцета и лазерных микро-диссекторе были интегрированы на модифицированном прямой микроскоп (BX51 - Olympus), оснащенных 60X, 0.9 NA водным погружением objective.The столик микроскопа состоит из 3-осевая линейная двигатель постоянного тока микро-позиционирование системы (M-126.CG1, физика-Instruments), перевозящих отдельные 3-осевой пьезоэлектрических нано-позиционирования этап (P-733.3DD, физика-Instruments), чтобы объединить грубой перемещение образца с суб-нанометровым разрешением пьезо- стадии. Система столике микроскопа был оснащен двумя контуров управления синергически, направленные на сохранение захвата точечной фокусировки в нужное положение, в зависимости от выбранного режима работы (должность или усилие смыкания, статический или динамический) ^16. В частности, внутренний контур обратной связи воздействует на пьезоэлектрический этапе сохранить шарик на выборЭд расстояние от центра ловушки. Другой внешний контур управляет положением платформа автоматизированного использовать регион, натянутое на пьезоэлектрический привод на большей площади, чем имеющиеся у него инсульт ^17. Когда пьезоэлектрический стадии достигает предела доступных хода в одном направлении, внешний контур перемещается микро этап в противоположном направлении, при этом пьезоэлектрический восстанавливается к его центральному положению, поскольку она отслеживания бусинка ловушке приклеен к образцу. Когда пьезоэлектрические этапе достигает центрального положения своего курса диапазона, микро этапе остановилась. Более подробная информация о системе приведены в Guiggiani др. ^16,17.

Устройство Пельтье (QE1 резистивного нагрева с TC-344B двойной контроллер нагревателя канал - Warner Instruments) контролирует температуру культуре клеток под микроскопом (37 ° C). В культуре, рН и влажность поддерживают на уровне физиологических условиях путем проветривания специально разработанный полидиметилсилоксановых (PDMS) Втулка (интеграции объектива микроскопа) увлажненным карбогена (95% O _2, 5% СО _2).

2. Подготовка клеточной культуры

Все экспериментальные протоколы были одобрены итальянским министерством здравоохранения. Первичные культуры были получены из гиппокампа мышей (C57BL6J, Charles River) на эмбриональный день 18 (E18).

1. Нейроны высевали при концентрации 25000 клеток / мл на стеклянным дном чашки Петри (P35G-0-14-C - Matek Corporation). Низкая концентрация культивируемые клетки необходимо, чтобы избежать образования густой сети уже в первые дни в пробирке. В указанной концентрации клеток, вероятность нахождения изолированных клеток с аксонами больше не подключен к другим клеткам гораздо выше.

3. Покрытие бисера

1. Полимер микросфер (диаметр 4 мкм, СООН-концевой Bangs лаборатории, код продукта PC05N/6700) покрывали поли-D-лизином по методике, описанной в белка polyLink Муфта Kit (Polysciences, код продукта 19539). Гранулы покрывают той же молекуле использоваться для покрытия поддержки культуры и адгезия пользу клеток.

4. Выберите изолированного нейрона. Снимите бисера от культурального субстрата, ловушку и переместите его рядом с Neuron

1. Поставьте блюдо культуры Петри на столик микроскопа. После установки фокуса на образце этапе движения, корректировать положение освещающего конденсатор целью установить Колер освещения. Выравнивание освещенности оптики установить Kolher-освещения условие является необходимым для улучшения качества изображения яркие области. Использование таких условий выравнивания, необходимо также, чтобы максимизировать сбор ИК КПД лазера (через объектив конденсатора), от рассеивающего ловушке зонда, для выполнения своих интерферометрический слежения по QPD и PD.
2. Пипетки несколько мкл покрытых раствора микросфер вк культуре блюдо. Микросферы сдаст и придерживаться культуры подложке. Количество мкл вводили в культуральную чашку зависит от микросфер концентрации маточного раствора. Идеальное состояние, чтобы иметь от одного до двух микросфер за изображения поля зрения. Когда слишком много микросферы будут добавлены в культуральную чашку, они уже могут придавать случайно в культивируемых нейронах.
3. Перемещение в чашку с культурой, в поисках изолированного нейрона с более длинной нейритов (аксон), а также сохранять положение столик микроскопа.
4. Передвигаться и искать шарик придерживался поддержки культуры.
5. Включите ИК лазерного захвата. На данном этапе, не голограммы не проецируются на ОДС, и положение места ИК лазерного совпадает с УФ положение лазерного пятна. Установка осевого положения пятна ИК 2-3 мкм над поверхностью поддержки культуры, под микроскопом движение стадии.
6. Установите мощность УФ лазерной переданной образцу до менее 1 мкВт.УФ лазер рассекатель ранее была откалибрована ^14:
   5-6 мкВт стеклянной подложки подвергается абляции
   4 мкВт нейронные связи полностью расчлененные
   2,5 мкВт нейрита частично поврежденных
   <1 мкВт ударная волна в культуре блюдо. Оптические ударная волна достаточно сильна, чтобы снять шарик из стеклянной подложки.
7. Включите УФ лазер, оставляя ИК лазер включен, и переместите УФ месте над придерживался шарик под микроскопом движение этапе. Шарик отделяется от поверхности, а его часть удерживается ИК лазерным. Затем выключите УФ лазер.
8. Переместить захваченных шарик несколько микрометров над стеклом поддержки (20-30 мкм). Подъем шарик эта позиция будет Ограничить контакт с другими клетками во время его двинулась к выбранной ранее нейрона. Принесите шарик к ранее сохраненной этапе положение. Установить этап скорость до низкого значения (10 мкм / сек), так что сила сопротивления жидкости не превышает оптическую ловушкуПинг силой.

5. Переместить Ловушка положение относительно лазерного пятна Dissector и Axon позиции по генерируемые компьютером голограмма, и откалибровать оптический пинцет Жесткость

1. Перемещение шарика в сторону стеклянной подложки для визуализации аксона. Шарик удерживается выше ячейки, чтобы избежать контакта с ним (приблизительно 5 мкм над стеклом поддержки).
2. Перемещение столик микроскопа, чтобы переместить УФ точка фокусировки по центру ширины аксона. Сохранить текущее положение этапе.
3. Переместить позицию ИК точечная фокусировка по компьютерной голограммы. На этом этапе стадии остановлен в положении, выбранного в предыдущем шаге. Когда компьютерная голограмма проецируется на ОДС, пойманным шарик перемещается по отношению к аксона. Перейдем ИК лазерного пятна иметь захваченных шарик выровнен по центру нейритов, с УФ лазерного пятна по центру же нейритов тоже. ИК месте и, таким образом захваченных шарика расположены вдоль аксонов5-10 мкм от УФ месте. Мы переместить положение ИК по отношению к УФ место в зависимости от нейритов геометрии. В случае оптических пинцетов не оснащены системой SLM, положение может быть изменено путем наклона зеркала, оптические или акустические дефлекторы, на ИК оптического пути. Локальный ИК-лазер может быть расположен 5-10 мкм от УФ месте, чтобы избежать оптического взаимодействия рассекает луч с захваченными зонд, который может влиять на его броуновского движения и изменить следы силовой спектроскопии.
4. После определения новом месте ИК-положении по отношению к УФ месте и аксон положение перемещения этап в положение захваченного шарик от аксонов и избежать столкновения с ним. Перемещение осевого положения захваченного шарик до около 2 мкм выше покровного стекла.
5. Совместите QPD в центре интерференционных полос на нем: х и у сигналов QPD дифференциальные нулей при QPD по центру. Приобретать 5 сек броуновского движения захваченных шарик по интерферометраметр, при частоте дискретизации 50 кГц. Получение жесткость (пН / нм) и чувствительность (В / нм) оптических ловушек методом спектра мощности ^18.

6. Прикрепите шарик аксона. Выполните аксотомии и одновременная Измерение силы

1. Поднимите захваченные позиции шарик примерно 4 мкм над крышкой стекла, и переместить его к ранее сохраненной этапе положение (см. п. 3.2).
2. Переместить в ловушку шарик вниз к аксона до его соприкосновения с аксонов. Столкновение между ловушке шарик и аксон контролируется сигнал г QPD обнаружения перемещения захваченной шарик в осевом направлении.
3. Подождите 10 сек с захваченными шарик прижимается к аксона в пользу его адгезию к нейрита мембраны.
4. Перемещение микро этап смещать шарик захваченных из аксонов и, таким образом проверить его адгезию к клеточной мембране. Если шарик придерживались, оно ускользает от оптической ловушке.
5. Отодвиньте лазерная ловушка на придерживались шарики включить силу зажима петли с силой состоянии равна нулю. Таким образом, пьезоэлектрические этап перемещает шарик, прикрепленный к клетке, на оптическом центре ловушки. Если система не имеет контроль обратной связи, положение лазерной ловушки можно перемещать предметный столик микроскопа его в центр на придерживались зонда. Центре ловушки достигается, когда QPD сигналы такие же, как когда шарик в ловушку и не привязан к ячейке (х и у QPD сигналов равна нулю, и Z QPD сигнал дает такую ​​же сумму напряжения из четырех квадрантов как тогда, когда шарик в ловушке далеко от поверхности).
6. Установить сила зажима условие на оси Z, позиционирование захвата лазерного чуть более центре шарик (около 100 нм), для создания претензией на придерживались ловушке зонда. В случае, если система не имеет с силой зажима управления, оптические ловушки положение может быть поднята с шагом 25 нм на предметный столик микроскопа. Сигнал Z QPD позволяет осуществлять мониторинг. Таким образом, использование Тхис сигналом, чтобы установить положение лазера ловушка по отношению к придерживались зонда. Такое предварительное натяжение необходимо ощущать напряжение на мембране аксона после поражения, и, как следствие снижением броуновского движения придерживались зонда. Аналогичный подход был предложен для измерения ослабления натяжения в мембране троса на видеоизображения ^19.
7. Выключения силу зажима обратной связи для измерения силы на придерживались зонда в положении зажима условие (пьезо-каскад заблокирован).
8. Начать одновременной записи захваченных позиции зонда через интерферометр (20 кГц частота дискретизации) и клетки во время лазерной аксотомии покадровой светлом поле визуализации (20 Гц частоты кадров).
9. Включите УФ лазер для доставки лазерного импульса, пока поражение не станет видимым на изображении аксона (обычно 200-400 оптических импульсов необходимы энергия импульса: 25. Нью-Джерси), затем выключите УФ лазер.
10. Продолжить запись на интерферометра в течение приблизительно 3 милиN, до X, Y и Z QPD следов не выходит на плато.

7. Определить общую снять напряжение

1. Преобразование записанных QPD следы (в вольтах) на калиброванной чувствительность оптической ловушки, для получения соответствующих следов в нанометрах.
2. Фильтр х, у, г и следы смещения фильтра верхних частот с отрезанными на частоте 10 Гц.
3. Рассчитайте общую дисперсию фильтруется следы представляющих броуновское движение захваченного шарик. Вычисляет дисперсию, при 25 мс шаги для перекрытия временных окон 500 мс (10 000 точек данных) ^20. Фильтрации верхних частот следов исключает изменение броуновское движение из-за колебаний мембраны или корковой движения актина. Броуновское движение шарика уменьшается на оптических сил и сил адгезии в клеточной мембране. Когда мембрана напряженными из-за ослабления натяжения ее вязкость повышается, и, следовательно, броуновское движение шарика, обнаружены сразуже после аксотомии, начинает уменьшаться.
4. Определить T0: начала снижения броуновского движения дисперсии, после поставки УФ лазерной энергии. Момент времени t0 указывает на начало мембраны штамма.
5. Определение t1: конец уменьшение дисперсии броуновское движение (когда он достигает плато). Момент времени t1 указывает конец мембраны штамма.
6. Видео выполнять отслеживание остатков или царапину на поддержку стеклянной крышкой, для измерения любых дрейф образца во время измерения силы. Чтобы отслеживать частицы на стекле поддержку, мы сначала применить пороги светлого поля изображения, чтобы получить стек бинарных изображений с частицей в белом на черном фоне. Тогда, мы отслеживаем частиц центра масс с суб-пиксельной точностью (с помощью бесплатного программного обеспечения ImageJ).
7. Вычтите измеренное дрейфуют от смещения QPD следов. Умножьте дрейф коррекцией QPD следы соответствующими калиброванный оптический жесткости (K _х, к _{Y, K Z), чтобы получить Fx, Fy, Fz следы в piconewtons.}
8. Рассчитайте общую след силу F _общ = √ ⁽² + Fx Fy ² + Fz ^2).
9. Рассчитайте общую релизе силы между T0 и T1 как F = F _{выпустила TOT} (T1) - F _TOT (t0). Сила, измеренная в момент времени t0 должно быть вычтено, потому что это из-за смещения зонда от центра ловушки, когда шарик прилипает к нейритов.
10. Вычислить нейритов площадь контакта между ловушку шарик и УФ положение лазерного пятна: на яркой мерой поля изображения длинные (L) и короткие (D) осей нейритов между ловушку шарик и УФ положение лазерного пятна. Площадь контакта аксона _аксона = L х Г
11. Нормализация общего выпущен силы F _{выпущен} площадь контакта аксона _{аксона.}

Результаты

Элемент генерирует тяговых усилий на подложке ее фокальные адгезии. Сила, порожденная элементами цитоскелета находятся в равновесии с противодействующей силой культуры подложке. После лазерной индуцированной повреждением аксонов, некоторые из напряженной кабелей цитоскелета разру...

Обсуждение

Мы сообщаем в этой работе количественные методы для сравнения нейрита адгезией к подложке культуры, при проведении одновременных измерений силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Измеренные снятие напряжения связан со степенью адгезии клетка с подложкой: кл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop