Цифровой Инлайн Голографическая микроскопия (DIHM) субъектов слабо-рассеяния

Резюме

Трехмерные местоположения слабо рассеивающих объектов может быть однозначно определены с помощью цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM), которая включает в себя незначительные изменения в стандартный микроскоп. Наше программное обеспечение использует простой визуализации эвристики в сочетании с Рэлея-Зоммерфельда обратного распространения, получая трехмерное положение и геометрию объекта микроскопической фазовой.

Аннотация

Слабо-рассеивающих объектов, например, маленькие коллоидных частиц и большинства биологических клеток, часто встречаются в микроскопии. Действительно, целый ряд методов были разработаны, чтобы лучше визуализировать эти объекты фазовые; фазовый контраст и ДВС являются одними из самых популярных методов для повышения контрастности. Тем не менее, запись положение и форма в вышедшего из изображений плоскости направлении остается сложной. Этот отчет представляет простой экспериментальный метод, чтобы точно определять место и геометрию объектов в трех измерениях, используя цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM). Вообще говоря, доступный объем образца определяется размером датчика камеры в поперечном направлении, а также освещения когерентности в осевом направлении. Типичные объемы проб в диапазоне от 200 мкм х 200 мкм х 200 мкм с использованием светодиодной подсветкой, чтобы5 мм х 5 мм х 5 мм и более с помощью лазерной подсветки. Этот света для освещения сконфигурировано так, что плоские волны падают на образец. Объекты в объеме образца затем рассеивают свет, который мешает нерассеянной света, чтобы сформировать интерференционных картин, перпендикулярном направлению освещения. Это изображение (голограмма) содержит информацию о глубине, необходимое для трехмерной реконструкции, и может быть захвачен на стандартном устройстве формирования изображения, таком как КМОП или ПЗС-камеры. Метод обратного распространения Рэлея-Зоммерфельда используется для численно переориентировать микроскопа изображения, и простой визуализации эвристический на основе фазы Gouy аномалия используется для идентификации рассеяния объектов в реконструированном объема. Этот простой, но надежный метод приводит к однозначному, безмодельного измерения местоположения и формы предметов в микроскопических образцов.

Введение

Цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM) позволяет быстро трехмерную визуализацию микроскопических образцов, таких как плавательные микроорганизмов ^1,2 и мягких систем материи ^3,4, с минимальными изменениями к стандартной установке микроскопа. В данной работе педагогического демонстрация DIHM обеспечивается, вокруг программного обеспечения, разработанного в нашей лаборатории. Эта статья включает в себя описание, как настроить микроскоп, оптимизировать сбор данных, и обрабатывать записанные изображения по реконструкции трехмерных данных. Программное обеспечение (основано частично на программное обеспечение, разработанное Д. Грира и другие ⁵⁾ и например, изображения находятся в свободном доступе на нашем сайте. Краткое описание приведено из шагов, необходимых для настройки микроскопа, реконструкции трехмерных объемов от голограмм и делают получившиеся объемы интерес с помощью бесплатного трассировки лучей пакет программного обеспечения. В документе делается вывод с обсуждения факторов, влияющих на качество реконструкции, И сравнение DIHM с конкурирующими методами.

Хотя DIHM был описан некоторое время назад (для общего обзора ее принципов и разработки, см. Ким ^6), требуемая вычислительная мощность и опыт обработки изображений до сих пор в значительной степени ограничили ее потребления специализированных исследовательских групп с упором на развитие приборов. Эта ситуация меняется в свете последних достижений в области вычислительной техники и технологии камеры. Современные настольных компьютеров может легко справляться с обработкой и требования к хранению данных; CCD или CMOS камеры присутствуют в большинстве микроскопии лабораторий и необходимая программа делается свободно доступны в Интернете по группам, которые вложили время в развитии техники.

Различные схемы были предложены для визуализации конфигурацию микрообъектов в трехмерном объеме пробы. Многие из них сканирования методы ^7,8, в котором Стек изображений записаны мechanically перевод плоскость изображения через образец. Сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопии, пожалуй, самый известный пример. Как правило, флуоресцентный краситель добавляют к фазового объекта для достижения приемлемого уровня образца отличие от этого, и конфокальный устройство используется для пространственно локализовать флуоресцентное излучение. Этот метод привел к значительному прогрессу, например, в коллоидной науки, где он разрешен доступ к трехмерной динамики переполненных систем ^9-11. Использование маркировки важное различие между флуоресценции конфокальной микроскопии и DIHM, но другие особенности двух методов являются стоит сравнивать. DIHM имеет значительное преимущество в скорости в том, что устройство не имеет движущихся частей. Механические зеркала сканирования в конфокальной системы установить верхний предел на скорость сбора данных - как правило, около 30 кадров / сек для 512 х 512 пикселя изображения. Стек таких изображений из разных фокальных плоскостях может быть получено физически Перляющего этап образца или объектив между кадрами, что приведет к окончательному скорости захвата около одного объема в секунду в течение кадра стека в 30. Для сравнения, голографическая система, основанная на современной CMOS камера может захватить 2000 кадр / с в то же размера и разрешения изображения, каждый кадр обрабатывается `в автономном режиме", чтобы дать независимую снимок объема образца. Повторюсь: люминесцентные образцы не требуются для DIHM, хотя система была разработана, который выполняет голографической реконструкции флуоресцентной теме ^12. А также трехмерная информация объем, DIHM также может быть использован для обеспечения количественных изображения фазового контраста ^13, но это выходит за рамки обсуждения здесь.

Изображения данных сырье DIHM являются двумерными, а в некоторых отношениях выглядят как обычные микроскопа изображений, хотя и не в фокусе. Основное различие между DIHM и стандартной яркий микроскопии лежит в дифракционных колец, которые окружают предметы ян поле зрения; это обусловлено характером освещения. DIHM требует более когерентный источник, чем светлом поле - обычно LED или лазерный. Дифракционных колец в голограммы содержит информацию, необходимую для реконструкции трехмерного изображения. Есть два основных подхода к интерпретации данных DIHM; монтируется непосредственно и численное переориентация. Первый подход применим в тех случаях, когда математическая форма дифракционной картины известных заранее ^3,4; это условие выполняется небольшой горстки простых объектов, таких как сферы, цилиндры и полуплоскости препятствий. Прямая установка также применимо в тех случаях, когда осевое положение объекта, как известно, и изображение могут быть установлены с использованием справочной таблицы шаблонов изображения ^14.

Второй подход (численный переориентации) является более общим и опирается на использование дифракционных колец в двумерной голограммы изображение, чтобы численно реконструировать оптического поля вряд (произвольно расположенных) фокальных плоскостях по всему объему образца. Существует несколько соответствующих методов для выполнения этой ^6; эта работа использует Рэлея-Зоммерфельда назад технику распространения, как описано Ли и Грира ^5. Итогом этой процедуры является Стек изображений, которые воспроизводят эффект ручного изменения фокальной плоскости микроскопа (отсюда и название `численное переориентация '). После того, как стек изображений был сформирован, положение объекта в фокальной объема должно быть получено. Ряд анализа изображений эвристики, таких как местные дисперсии интенсивности или пространственного частотного спектра, были представлены в количественной резкость фокуса в различных точках в образце ^15. В каждом случае, когда конкретное изображение метрика максимизируется (или свести к минимуму), то объект считается в фокусе.

В отличие от других схем, которые стремятся идентифицировать конкретный фокальной плоскости, где объект находится «в фокусе», метод в этой работе выделяет рoints, которые лежат внутри объекта интереса, которые могут расширить в широком диапазоне фокусных плоскостей. Этот подход применим к широкому кругу предметов и особенно подходит для расширенных, слабо рассеивающих образцов (фаза объектов), например, в форме стерженьков коллоидов, цепей бактерий или эукариотической жгутиков. В таких образцах контрастность изображения изменяется, когда объект проходит через фокальной плоскости; расфокусированный изображение имеет светло-центр, если объект находится на одной стороне фокальной плоскостью и темным центром, если это с другой стороны. Объекты чистой фазе практически не имеют отличие, когда они лежат именно в фокальной плоскости. Это явление инверсии контраста был обсужден другими авторами ^16,17 и, в конечном счете связано с фазой Gouy аномалия ^18. Это была поставлена ​​на более строгой основе в контексте голографии в другом месте, где пределы технике оцениваются; типичный неопределенность в положении порядка 150 нм (примерно один пиксель) в EACч направление ^19. Метод фазовой аномалия Гуи является одним из немногих четко определенных схем DIHM для определения структуры протяженных объектов в трех измерениях, но тем не менее некоторые объекты являются проблематичными для восстановления. Объекты, которые лежат прямо вдоль оптической оси (указывая на камеру) трудно реконструировать точно; неопределенности в длине и положении объекта становятся большими. Это ограничение частично из-за ограниченного битной глубиной пикселов записи голограммы (число различных уровней серого, которые могут записывать камера). Еще одной проблемной конфигурации происходит, когда объектом интереса очень близко к фокальной плоскости. В этом случае, реальные и виртуальные образы объекта реконструируются в непосредственной близости, что приводит к сложным оптических полей, которые трудно интерпретировать. Второй, чуть менее важной задачей здесь является то, что в результате дифракции полосы занимают менее от датчика изображения, и этот крупном гранулометрическом инфormation приводит к реконструкции беднее качества.

На практике простой градиент фильтр применяется к трехмерных реконструированных объемов обнаружить сильные инверсии интенсивности вдоль направления освещения. Регионы, где интенсивность быстро изменения от светлого до темного, или наоборот, затем, связанные с рассеянием регионах. Слабо рассеивающие объекты хорошо описаны в качестве невзаимодействующих сбора таких элементов ^20, эти суммы отдельных вкладов, чтобы дать общее рассеянное поле, которое легко перевернутой с помощью обратно способ распространения Рэлея-Зоммерфельда. В данной работе осевое техника градиент интенсивности применяется к цепи Streptococcus клеток. Клеточные тела фазовые объекты (виды кишечной палочки имеет показатель преломления, измеренный ^21, чтобы быть 1.384 на длине волны λ = 589 нм; штамм Streptococcus, вероятно, будет похож) и появляются в виде высокой интенсивности цепь связанных капли в йОбъем э образец после градиентного фильтра была применена. Стандартные пороговые и художественные методы экстракции, применяемые к этой фильтрованной объеме позволит добычу объемных пикселей (вокселов), соответствующих области внутри клеток. Особым преимуществом этого метода является то, что она позволяет однозначно реконструкцию положение объекта в осевом направлении. Подобные методы (по крайней мере, те, которые записывают голограммы близко к объекту, распечатанных с помощью объектива микроскопа) страдают от невозможности определить знак этого смещения. Хотя метод реконструкции Рэлея-Зоммерфельда также регистрации независимой в этом смысле операция градиент позволяет нам различать слабых фазовых объектов выше и ниже фокальной плоскости.

протокол

1. Настройка и сбора данных

1. Расти культуры Streptococcus штамма V4051-197 (гладкая плавание) клеток в KTY среды от замороженной ^22. Инкубировать в ротационном шейкере в течение ночи при 35 ° С и 150 оборотах в минуту, до насыщения.
2. Инокулировать 10 мл свежей среды KTY с 500 мкл насыщенного культуры. Инкубировать в течение еще ​​3,5 ч при 35 ° С и 150 оборотах в минуту, пока клетки не достигнут оптическую плотность приблизительно 1,0 при λ = 600 нм (приблизительно 5 × 10 ⁸ клеток / мл).
3. Развести 1:400 в свежей среде, чтобы получить конечную концентрацию подвижных клеток.
4. На предметное стекло микроскопа, сделать кольцо смазки (например, из шприца, заполненного вазелином) около 1 мм в высоту и поместить каплю раствора образца в центре. Поставьте покровного стекла сверху и слегка нажмите на краях, чтобы запечатать, гарантируя, что жидкость находится в контакте с обоих горкой и покровного стекла. Полученный образец камера должна быть Arouй 100-200 мкм в глубину.
5. Поместить камеру с образцом в микроскоп с покровное стекло вниз и осторожно, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в масле между стеклом и линзой.
6. Фокус микроскопа на нижней поверхности камеры для образца, и довести конденсатор для фокусировки.
7. Выключите Стандартное освещение и разместить светодиодную головку за конденсатора апертуры микроскопа. Установите светодиодный источник питания к максимальной мощности.
8. Закройте конденсатора диафрагмы до упора, а при необходимости, подтолкнуть светодиод в своем горе, пока освещение не сосредоточена на объективной диафрагмы объектива.
9. Включите компьютер и камеру, и перенаправить весь свет порту камеры микроскопа. Отрегулируйте частоту кадров и размер изображения в программе захвата изображений.
10. Сделать время экспозиции кадра как можно короче, все еще сохраняя хорошую контрастность. Проверьте гистограмму интенсивности изображения для того, чтобы изображение не насыщенияТед или недоэкспонированной.
11. При необходимости переориентировать микроскоп так, что объект, представляющий интерес, слегка расфокусированный (как правило, на 10-30 мкм). Объект и фокальной плоскости должны быть в той же среде (т.е. в фокальной плоскости должны лежать внутри пробоотборной камеры).

2. Реконструкция

Первый шаг обработки данных для численного переориентировать видеокадра в серии различных глубинах, производя пачку снимков. Удобное программное обеспечение для этого можно найти здесь: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html наряду с примерами изображений (приобретенных использованием инвертированного микроскопа, и масло погружения объектива 60X) и файл сцены, для луча прослеживается рендеринга.

1. Входной кадр интерес и его соответствующий фон в виде отдельных файлов изображений, в соответствующих графах на интерфейсе. Фоновое изображение это кадр, который еairly представляет фон видео, в отсутствие голограммы, и будет использоваться для подавления любой фиксированной структурный шум, который может помешать локализации и анализа голограммы.
2. Введите значения в глобальные настройки коробки на левой стороне экрана перед запуском программы. Первые три выходных параметров стек: Осевое положение первого кадра ("Начать фокус"); количество срезов в реконструированном стек ('Число ступеней'), осевое расстояние между каждого среза в стеке ('Размер шага') .
3. Для реконструкции объектов с нужной пропорции, размер шага должен быть тот же размер, поперечный шаг пикселя. Введите боковую частоту дискретизации камеры (расстояние 1/pixel) в поле "Pixel / микрон", с длиной волны освещения и среднего показателя преломления в течение последних двух коробках. Значения по умолчанию программы являются подходящими для восстановления данные примера.
4. Нажмите кнопку "Флип Z-градиент", если центр OBJEКТ темно в голограмме (см. пример кадр 2005 и в разделе обсуждения для более подробной информации).
5. Проверьте полосовой фильтр вкл / выкл состоянии (по умолчанию включен). Этот дополнительный полосовой фильтр, расположенный в поле ниже переключателя градиент-флип, отвечает за подавление вклада шумных пикселей. Полосовой фильтр применяется к каждому срезе изображения сразу после поколения.
6. Проверьте промежуточный выходной выключатель ON / OFF государств (по умолчанию включен). Шаги средний анализ написаны на двух выходных видео, как несжатый AVI файлов:. Во-первых, переориентировал стека (название файла заканчивается в '_stack.avi'), второй стек после осевого операции градиента (название файла заканчивается в ' _gradient.avi '). В идеале это второй стек будет содержать объектом интереса выделены как яркий объект на темном фоне.
7. После установки всех параметров, нажмите "Выполнить" в главном окне. Выбранная рамка появится на главной окне программного обеспечения.
8. Используйтеувеличительное стекло инструмент найти на панели инструментов в левой части изображения, чтобы увеличить масштаб (щелкните левой кнопкой мыши) и уменьшения масштаба (Shift + левый клик). Используйте инструмент прямоугольник на панели инструментов, выберите регион интереса (ROI). Захват как многие из полос голограммы, как это возможно внутри прямоугольника, так как это позволит оптимизировать реконструкции.
9. Нажмите кнопку «процесс» для генерации двух стеки. Проверьте получившиеся стеки, используя ImageJ (который можно получить бесплатно на http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Если объектом интереса можно ясно увидеть в стеке градиента изображения, перейдите к следующему шагу, чтобы извлечь координаты объекта.

3. Оказание

1. Кроме того кадра переориентации, эта программа может найти х, у, г координаты для каждого воксела в объекте интереса. Нажмите кнопку 'Функция извлечения ", чтобы включить эту функцию.
2. Введите путь, в том числе расширения (например: C: главная output.inc), дляВыход координирует файл. Выберите 'POV-Ray стиль "в поле" выход координат стиль "окне. Это вызывает программа писать объектный файл, который может быть визуализированы при помощи бесплатного POV-Ray трассировки лучей пакет программного обеспечения (которое может быть получено от http://www.povray.org/ ).
3. Повторная обработка изображений, что и в разделе 2 выше. Программа обеспечит серию (х, у, г) координирует в выбранном ROI, написанный на имя файла в "Выход координат 'коробки. Добыча координат объектов значительно больше занимает, чем стека поколения.
4. Убедитесь в том, что образец POV-Ray файл (поставляется с кодом реконструкции) находится в той же папке, координаты подать только что генерируется. Измените файл образца. POV и заменить имя файла в кавычках на линии
   # Включить "MYFILE.inc"
   с именем файла данных, генерируемого кода реконструкции.
5. Нажмите кнопку "Выполнить" в POV-Ray для визуализации растрового изображения. Тон положение камеры, освещение и варианты текстуры лишь некоторые из настроек, возможных в POV-Ray; см. электронную документацию для деталей.

Результаты

Для демонстрации возможностей DIHM были проведены эксперименты по цепочке Streptococcus бактерий. Сам цепи измеряется 10,5 мм в длину, и в ее состав 6-7 сферо-цилиндрической клеток (два из клеток в цепочке близки к деления) с диаметром в диапазоне 0,6-1 мкм. Рисунках 1а и 1b показ?...

Обсуждение

Наиболее важным шагом в этом протоколе является точной захват снимков с устойчивой экспериментальной установки. С бедных исходных данных, высокая реконструкция верность почти невозможно. Важно также, чтобы избежать объективы с внутренним контрастного элемента фазы (видимого в виде т...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362