Чувствительным методом для количественной стареющие клетки рака

Резюме

Ли старение предотвращает или способствует туморогенез остается спорным. Поскольку химиотерапевтические препараты могут вызывать раковые клетки стареть, изучая старение имеет важное значение для предложения новых методов лечения. Однако, стандартный и широко используется β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Мы предлагаем здесь Быстрый и чувствительный проточной цитометрии на основе анализа для количественной старения.

Аннотация

Клетки человека не бесконечно размножаться. От внешних и / или внутренних сигналов, клетки могут погибнуть или введите стабильной арест клеточного цикла называется старением. Несколько клеточные механизмы, такие, как укорочение теломер и аномальной экспрессии онкогенов митогенных, было показано, что причиной старения. Старение не ограничивается нормальными клетками; раковые клетки Сообщалось также, что стареют.

Химиотерапевтические препараты индуцируют старение в раковых клетках. Однако остается спорным ли старение предотвращает или способствует туморогенез. Как это в конечном итоге может быть конкретного пациента, Быстрый и чувствительный метод оценки старение в раковой клетке вскоре будет необходимо.

Для этого, стандартные β-галактозидазы анализа, используемые в настоящее время методы представлены основные недостатки: она занимает много времени и не чувствительна. Мы предлагаем здесь проточной цитометрии анализа на основе изучения старения на Ливе клеток. Этот тест дает преимущество в том, быстрый, чувствительный, и может быть соединен с иммунного различных клеточных маркеров.

Введение

С начала шестидесятых годов и его открытия и Хейфликом Moorhead, старение остается сотовая любопытства ^1. Клетки человека не бесконечно размножаться и, по старению, Хейфликом и Мурхеде придумал клеточный процесс старения. Старение является стабильным клеточного цикла, в котором клетки остаются метаболически активными по сравнению с клеточной смерти. На сегодняшний день четыре клеточные механизмы, как было показано, чтобы вызвать старение: укорочение теломер, повреждение ДНК, хроматин возмущение, и аномальной экспрессии онкогенов митогенных ^2. Это означает, что не только нормальные клетки, но и раковые клетки могут подвергаться старению ^3. В самом деле, раковые клетки проходит старение было показано, представляет собой барьер для дальнейшего прогрессирования опухоли ^4-5. Тем не менее, в нескольких докладах уже отметили, что, при определенных обстоятельствах, клеточное старение может также способствовать злокачественной ^6-7. Изучение старения рака челLs собирается стать желание в исследовании рака в настоящее время используется в качестве химиотерапевтических препаратов может привести к старению раковых клеток не только в пробирке, но и в естественных условиях ^8.

Мастер анализа исследовать на наличие стареющих клеток является β-галактозидазы анализа при кислом рН. Это гистохимическую анализа отражает возросшую в лизосомальных биогенеза, происходящих в самых стареющих клеток. Вкратце, экзогенный X-гал, применительно к клеткам, расщепляется с помощью β-галактозидазы, обогащенный лизосомах стареющие клетки, что приводит к синим цветом ^9. Синий стареющие клетки могут быть количественно под ярким поле микроскопа. Хотя очень популярны, β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Во-первых, этот анализ проводят на фиксированных клеток. Во-вторых, это отнимает много времени, потому что оно подразумевает Для количественной оценки степени старения путем подсчета значительно большим числом стареющие клетки под микроскопом. В-третьих, этот анализне чувствительна как дискриминацию между стареющими и не стареющие клетки полностью зависит от наблюдателя.

Здесь мы обсудим неиспользованными, быстрый и чувствительный цитометрии на основе анализа на предмет наличия живых стареющие клетки. Этот анализ основан на гидролизе проницаемые мембраны молекул 5-dodecanoylaminofluorescein ди-β-D-галактопиранозида (C _12-ФДГ), на β-галактозидазы, обогащенный стареющих клеток. После гидролиза и лазерным возбуждением, C ₁₂ ФДГ испускает зеленую флуоресценцию и поэтому могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, ^{10, 11.} Обнаружение стареющие клетки через проточной цитометрии предлагает большое преимущество, что быстрого и чувствительного. Кроме того, обнаружение стареющих клеток методом проточной цитометрии могут быть связаны с обнаружением других клеточных маркеров. Этот анализ может быть использован для обнаружения стареющих клеток в популяции раковых клетках, обработанных с химиотерапией и может быть обычно установленна срезах тканей, после сотовые диссоциации, в клинике.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка C12FDG, Bafilomycin A1, и в клеточной культуре

1. Растворить С ₁₂ ФДГ порошок в диметилсульфоксиде (DMSO) до конечной концентрации 20 мМ. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С. ДМСО следует использовать с соответствующих безопасных условиях.
2. Растворить порошок bafilomycin A1 в ДМСО до конечной концентрации 0,1 мМ. Алиготе и хранить при температуре - 20 ° С. Bafilomycin должны использоваться с соответствующими условиями безопасности.
3. Культивируйте RPMI 8226 клеточной линии или другие клеточные линии, прилипшие или нет, в среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотиков, при 37 ° С, 5% СО _2. Оценить количество клеток, необходимых для эксперимента. Чтобы записать достаточное количество событий во время анализа проточной цитометрии, 5 × 10 ⁵ клеток не требуется. Чтобы определить процент стареющие клетки, клетки трех образцов необходимо: немеченого образец, необработанные клетки окрашивали С ₁₂ ФДГ, обработанные клетки окрашивалиС ₁₂ ФДГ.
4. Семенной элементы 24 ч до проведения эксперимента, так что клетки находятся в лог-фазе клеточного кривой пролиферации.

2. Индукционные старения

1. Индуцируют старение раковых клеток путем добавления химиотерапевтического препарата. Концентрация наркотиков и продолжительность лечения должна быть адаптирована к типа клеток испытания. Начало с 48 ч обработки при конечной концентрации 50 нМ доксорубицин при концентрации клеток примерно 10 ⁶ клеток / мл. Не забудьте включить необработанном образце (отрицательный контроль).

3. Bafilomycin A1 Лечение

1. Проверка жизнеспособности клеток путем смешивания клеток с трипановым синим (об / об) в качестве химиотерапевтических препаратов, используемых в предыдущем шаге может привести к апоптоз клеток. Заполните в камеру Malassez и подсчитать количество голубые клетки (мертвые клетки) и белых клеток (живые клетки). Если процент жизнеспособности составляет менее 70%, мертвые клетки могут быть бэрОведа помощью соответствующего комплекта для обеспечения, что мертвые клетки не будет смещения последующего анализа.
2. Снимите питательных сред и заменить свежей среде нагретого культуры. Лечение клеток с конечной концентрации 100 нМ bafilomycin A1. Bafilomycin A1 используется для нейтрализации кислых рН лизосом. Инкубируют 1 ч при 37 ° С, 5% СО _2.

4. С ₁₂ ФДГ Окрашивание

1. Растворить С ₁₂ ФДГ в предварительно нагретой свежую культуральную среду до конечной концентрации 2 мМ.
2. Добавить соединение с клетками, в конечной концентрации 33 мкМ и инкубируют 2 ч при 37 ° С, 5% СО _2. При использовании неприлипшие клетки, Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С (скорость, возможно, придется быть настроен на тип клеток использовали), промывают 2 раза с PBS. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл холодного PBS. При использовании прилипшие клетки, извлекайте носитель и мыть 2x с PBS. Урожай прилипшие клетки с использованием раствора трипсина и центрифугиКлетки при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С (скорость может должны быть скорректированы в клетку типа используется). Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл холодного PBS. В обоих случаях концентрации клеток должно быть около 10 ⁶ клеток / мл.
3. Выполнить совместно иммунного для дальнейшей характеризации населения стареющих клеток.

5. Анализ проточной цитометрии

1. Калибровка проточной цитометрии с помощью элемента управления бусы рекомендованных производителем проточном цитометре. Для всех шагов, по крайней мере 10 ⁴ события должны быть записаны.
2. Запуск первого образца, содержащего немеченой клеток. Подготовьте двухпараметрическое графического отображения прямого канала рассеяния (FSC) против бокового рассеяния Channel (SSC). Установка фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и определить области, представляющей интерес исключением мертвых клеток и клеточных остатков, которые могли бы появились в пробоподготовки. Ворота этой области интереса в однопараметрическим отображения гистограммы FL1 на логарифмической шкалена оси абсцисс, а число событий в оси у. Общее количество событий представляет собой количество клеток анализируют. Установите PMT, чтобы немеченой клетки появляются в первой декаде на бревне масштаб оси абсцисс. Определение флуоресценции клеток, если это необходимо.
3. Запуск второго образца, содержащего необработанными клетками. С одной параметров отображения гистограммы FL1 (флуоресценция C ₁₂ ФДГ), поместите курсор после смутно помечены населения. Этот порог позволит дискриминации между не-стареющих клеток (тускло меченых клеток) и стареющих клеток (ярко меченых клеток).
4. Выполнить третий образец, содержащий обработанные клетки. Ярко меченых клеток, то есть стареющие клетки появляются выше порога, определенного на предыдущем шаге. Вычислить процент стареющих клеток путем деления количества ярких событий на общее количество событий. Если необходимо, активность β-галактозидазы также может быть оценена с использованием средней флуоресценцииинтенсивности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Множественная миелома, гематологические злокачественные опухоли, был использован для оценки старение индуцированного химиотерапевтические процедуры. Для этого коммерчески доступные линии клетки ММ (RPMI 8226) лечился в течение 2 дней с доксорубицином, химиотерапевтических препаратов. З...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы представили здесь проточной цитометрии на основе количественного метода определения клеточного старения в живых клетках рака. Этот метод основан на использовании мембраны проницаемой соединения, C ₁₂ ФДГ, и поэтому может быть использован в любом типов клеток и после различных...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside	Invitrogen	D-2893
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Bafilomycin A1	Sigma	B1793
Doxorubicin	Sandoz
Trypan blue	Sigma	T8154
RPMI 1640 cell culture medium	Lonza	BE12-702
Fetal calf serum	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter	A94291