<em&gt; В ово</em&gt; CAM-анализа, как Xenograftmodel саркомы

Резюме

В ово Хориоаллантоисную мембраны (CAM) прививается со свежими саркомы полученных опухолевых тканей, их одноклеточных суспензий, и постоянные и переходные флуоресцентно меченых линий установлено саркома. Модель используется для изучения трансплантат (жизнеспособность, Ki67 индекс пролиферации, некроза, инфильтрация) и хост (инфильтрация фибробластов, сосудистый врастание) поведение.

Аннотация

Саркома очень редкая болезнь, которая неоднородна по своей природе, все тормозящие развитие новых методов лечения. У пациентов с саркомой являются идеальными кандидатами для персонализированной медицины после стратификации, объясняя текущую заинтересованность в развитии воспроизводимым и недорогие модели ксенотрансплантации для этого заболевания. Мембрана хорионалантоисной является естественным иммунодефицитных хозяина способны поддерживать привитых тканей и клеток без видоспецифической ограничений. Кроме того, он легко доступен, манипулировать и визуализируют с помощью оптических и флуоресценции стереомикроскопия. Гистологии в дальнейшем позволяет детальный анализ гетеротипические клеточных взаимодействий.

Этот протокол подробно описывает в ово прививки хориоаллантоисную мембраны со свежими саркомы полученных опухолевых тканей, их одноклеточных суспензий, и постоянные и переходные флуоресцентно меченых создана саркомы клеточных линий (Saos-2 и SW1353). Крыса куриных выживанияES являются до 75%. Модель используется для изучения трансплантат (жизнеспособность, Ki67 индекс пролиферации, некроза, инфильтрация) и хост (инфильтрация фибробластов, сосудистый врастание) поведение. Для локализованных прививки одноклеточных суспензий, ECM гель обеспечивает значительные преимущества по сравнению с инертными материалами сдерживания. Ki67 индекс пролиферации связано с расстоянием клеток от поверхности САМ и длительность применения на САМ, последнее определение временных рамок для того терапевтических продуктов.

Введение

Саркома редкая опухоль соединительной ткани с высокой смертностью из-за терапии ^1,2 сопротивление. Прогресс в выживаемости пациентов затрудняется их низкой ежегодной заболеваемости, их широкое разнообразие, а также тот факт, что клетки саркомы, как сообщается, трудно культуры в пробирке ^3,4.

Использование культивируемых клеток на доклинической оценки терапии показали, что новый, по-видимому активных молекул в пробирке не всегда отражают результаты в клинических условиях. Кроме того, геном аберраций, выявленных массивов экспрессии генов не всегда коррелирует с опухолью характеристик поведения в отдельных пациента ^5-7. Для того, чтобы попытаться решить эти проблемы, персонализированная медицина значение приобретает, которое отражается в увеличении поиск ксенотрансплантатом ^8-12 моделей.

В анализе естественных условиях имеет то преимущество, отражающие сложное взаимодействие между сANCER клетками и окружающей средой ткани хозяина в солидных опухолях, необходимые для распространения рака и вторжения ^13. В настоящее время изучаются использование Хорье-аллантоисных Мембрана анализа (CAM-анализ), как воспроизводимые модели ксенотрансплантата саркомы ^14,15. Этот тест широко используется для изучения опухолевого ангиогенеза ^16,17. В литературе, однако, мы нашли различные протоколы для этого анализа, в то время как другие исследования наблюдалось заметное различие в росте или ангиогенез в соответствии с различными протоколами ^18,19.

В этой статье мы исследуем влияние изменения условий CAM-анализа на поведение клеток опухоли использованием трансплантаты, полученные из опухоли одноклеточных суспензий и сложившейся культуры клеток саркомы.

протокол

См. рисунок 1 для обзора

Опухоль материала

1. Получение и подготовка образцов опухолей

Для использования материала пациента, утверждение этического комитета необходимо, и осознанное согласие должно быть получено от пациента.

1. Урожай репрезентативном материале (минимум 1 см ³⁾ во время вмешательства, либо биопсии или резекции саркомы. Надлежащее место биопсии определяется с помощью динамической контрастности МРТ.
2. Поместите материал непосредственно в стерильную пробирку, содержащую DMEM дополнена 1000 U пенициллина и 1 мг / мл стрептомицина.
3. Транспорт флакона немедленно (30 - 90 мин) в лабораторию.

Все Следующие процедуры выполняются под ламинарного потока.

4. Залить содержимое флакона в стерильную чашку Петри.
5. Поместите образца опухоли на мелкие части максимально 1 м.м ³ с использованием стерильным скальпелем. Удалить все кальцинированные частей, поскольку они имеют тенденцию ухудшать дальнейшей обработки ткани.
6. Случайно занять 10 опухоли трансплантатов для применения на CAM.

2. Подготовка из опухоли одноклеточных суспензий

Приблизительная продолжительность: 3 часа

1. Взвесить оставшиеся ткани образца.
2. Поместите 2 - 4 г ткани в диссоциатора трубки, более чем одна трубка может потребоваться переваривать все оставшиеся ткани опухоли.
3. Для переваривания 2 - 4 г ткани, добавляют 2,5 мл коллагеназы два решения (500 Ед / мл RPMI 1640) и 2,5 мл ДНКазы раствор (22 KU / мл RPMI 1640).
4. Обработайте ткань в соответствии с протоколом h_tumor диссоциаторе. Это включает в себя два цикла инкубации при 37 ° C в CO _{2-инкубаторе} при трубки осторожно встряхивали в течение 30 мин.
5. Фильтр оставшейся суспензии через 150 мкм ячейки фильтра.
6. Центрифуга лизата на 1000 оборотов в минуту в течение 5 мильN.
7. Удалить супернатант.
8. Ресуспендируют осадок в 10 мл буфера для лизиса эритроцитов (УЛК), позволяющие 10 мин инкубации с регулярными подвески.

Примечание: буфера для лизиса эритроцитов изготавливают следующим образом: Добавить 0,037 г ЭДТК, 0,99 г K ₂ HPO _4, 8,29 г NH ₄ Cl до 1000 мл вода, использовать 10 N NaOH для доведения рН до 7,3, фильтр под давлением через 0,22 мкм процедить. Хранить при температуре 4 ° C.

9. Добавить 25 мл культуральной среды (DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), чтобы остановить реакцию.
10. Центрифуга суспензии при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин. Цвет гранул должен быть белым теперь.
11. Удалить супернатант.
12. Добавляют 5 мл среды к осадку. Суспензию фильтруют через сито ячейка 70 мкм.
13. Подсчет количества живых клеток / мл с помощью автоматического счетчика клеток.

3. CANCER клеточных линий

SAOS2 остеосаркома клетки (АТСС номер: HTB-85) с улучшенными зеленый флуоресцентный белок подвергали электропорации по peGFP-C1 вектора с использованием клеточной линии Nucleofector Kit V в соответствии с протоколом производителя. Чтобы установить стабильные клеточные линии, трансфицированные клетки отбирали в G418 (1 мг / мл) в течение 4 недель в соответствии с ранее установленным протоколом ^20. Кроме того сортировки была выполнена с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) в соответствии с инструкциями производителя.

Клетки SW1353 хондросаркомой линии клеток (АТСС номер: HTB-94), либо свежеприготовленным опухоли одноклеточных суспензий помечены использованием красного флуоресцентного липофильные мембраны пятно.

1. Удалить клеток от культуральной колбе в классическом способом с использованием трипсина (0,5% вес / объем) этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, 0,2% вес / объем) раствора.
2. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
3. Снимите supernatant.
4. Добавить 1 мл бессывороточной среды и 5 мкл DiI (Vybrant Красный) / 10 ⁶ клеток.
5. Оберните флакона в алюминиевую фольгу и положить его в CO ₂ инкубаторе в течение 10 мин при 37 ° С.
6. Центрифуга снова в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту и ​​удалить супернатант.

Хориоаллантоисную анализа мембраны

1. Инкубация яиц

1. Оплодотворенные яйца из местных коммерческих инкубатора гарантирует 95% оплодотворения яиц требуется.
2. Оплодотворенные яйца можно хранить при комнатной температуре до 10 дней.

Примечание: перед началом инкубации, грязи, перья и экскременты тщательно удалены из скорлупы механически путем протирки сухой с бумажными полотенцами, которые имеют грубую а не мягкую структуру поверхности. Очистка яйца с 70% денатурированный этанол или любой другой реагент очистки значительно снижает выживаемость эмбрионов кур.

3. Положите яйца в incubАТОР, с одной стороны, маркировка верхней поверхности. День, в который яйца помещаются в инкубатор назначенный день 0 эмбрионального развития.
4. Установка температуры инкубации при температуре 37,8 ° С и влажности 47%. Убедитесь, что опция автоматического вращения выключен.

2. Открывающиеся части яйца

Продолжительность: ± 60 мин для 25 яиц

На 3-й день развития, яйца открыт под ламинарный воздушный поток. Открытие яйца на дальнейшее развитие результатов этапа к повреждению CAM, как мембрана имеет тенденцию прилипать к оболочке. Инфракрасная лампа используется для держать яйца теплой во время процедуры. Для улучшения бесплодие, мы рекомендуем использовать перчатки руки.

1. Положите яйцо в Eggcup, с отмеченными стороной вверх.
2. Нижний уровень CAM путем удаления двух мл белка через 18 G иглу на конце яйца. Если игла тупая после перфорации несколькояичная скорлупа, замените иглу. Если нет, слишком много сил должно быть оказано, что приводит к повреждению яичный желток или разрушения оболочки. Иногда игла заблокирован chalazae, один из 2 ленту по спирали приостановлении желток в белке. Эту проблему можно решить, осторожно нажимая на поршень вниз, пока блок не будет устранена. Если яичный желток всасывается в шприц, замены иглы, а также шприца. Иногда эмбрион умирает после этого события. Если недостаточное количество белка удаляется, CAM будет повреждена, когда оболочка удалена.
3. Применение полупроницаемой клейкой пленки в отмеченных верхней стороне корпуса для того, чтобы предотвратить разбрызгивание частицы оболочки на САМ во время резки окна.
4. Сделать впускных отверстий с небольшим шило на поверхности яйца.
5. Вырезать окно 1 см ² в корпусе, с использованием пары стерильных острыми хирургическими ножницами.
6. Пульсирующее сердце эмбриона и прилегающих сосудов может наблюдаться при йэлектронной поверхность яичным желтком. Снимите неоплодотворенных яиц или мертвых эмбрионов. Прерванный аспект кровеносных сосудов характеризует мертвых эмбрионов.
7. Закройте окно с полупроницаемую клейкая пленка. Это не обязательно, чтобы покрыть места прокола, если цистерна не дал трещину во время введения иглы.

3. Прививка процедуры

Продолжительность: ± 1 час на клеточной линии

На куриного эмбрионального развития 9-й день, яйца засевают под ламинарный воздушный поток.

Оценка раковых клеток распространяется по всей CAM требует локализации клеток в ограниченной поверхности в процессе модифицирования. Матригель является внеклеточным матриксом (ECM) гель с Engelbreth-Холма-рой мышиной саркомы часто используется в экспериментальных условиях культивирования клеток. Это жидкость при охлаждении, но будет проходить термически активированного полимеризации при доведен до 20 - 40 ° C, образуя устойчивый гель. Во времяЭксперименты, Матригель хранится в коробке, содержащей таяния льда.

Примечание: Мы настаиваем на том, чтобы не использовать перфорированные покровные. Мы наблюдали прикрепления и роста трансплантированных клеток рака на пластиковый диск таким образом смещение потенциала роста клеток на самой мембраны.

1. Ресуспендируют осадок клеток в охлажденный гель ECM при концентрации 10 ⁶ клеток/100 мкл гель ECM. Имейте это решение на тающем льду.
2. Акцизной части полупроницаемую мембрану с парой стерильные хирургические под ламинарным потоком воздуха. Если клей пленка удаляется полностью, это приведет к большей доли эмбриональной смерти из-за загрязнения.
3. Прикоснитесь к CAM прямо под окна оболочки слегка стерильной стеклянной палочкой, чтобы удалить слой эпителиальных клеток. Прикосновение к CAM стерильную стеклянную палочку, оказывается, менее травматично, чем с помощью скальпеля № 11, которая требует больше удобство и опыта. Мелкие кровоизлияния могут произойти.
4. dding опухоли материала.
5. Для опухолевых трансплантатов: осторожно нижнюю часть ткани на САМ с парой стерильным пинцетом, не сжимая его.
6. Для процедуры гель ECM: Добавить 4x 25 мкл клеточной-ECM суспензия геля на CAM, в верхней части друг с другом, позволяя гель ECM для полимеризации между приложениями. Таким образом, прилипшие налета содержащие раковые клетки создан.
7. Закройте окно оболочки снова полупроницаемую клейкая пленка.

4. Изображениями и уборки CAM

Продолжительность: 2 часа на 25 яиц

На куриного эмбрионального развития 16-й день САМ собирают. Работая под ламинарным потоком воздуха не требуется.

1. Увеличить окна с парой хирургическими ножницами. Убедитесь в том, чтобы не порезать слишком низко, иначе CAM будет повреждена, в результате чего кровотечение из поврежденных кровеносных.
2. Добавить 300 - 500 мкл PBS ^D с помощью пипетки на секту CAMион содержащий привитый материал. Если ни флуоресцентных зондов не используются, буферном растворе формальдегида могут быть использованы как это делает мембраны жесткой, что облегчает резку мембраны.
3. Сделайте фотографию CAM в яйце через стерео флуоресцентный микроскоп, оснащенный цифровой камерой цвета, используя как GFP или DSR фильтр, а фильтр. Для опухолевых трансплантатов, все фотографии сделаны без фильтров. Освещение сверху светодиод настоятельно рекомендуется во время фотографирования (рис. 2).
4. Запись опухолевых клеток миграции меченых клеток. Границы опухоли могут быть нерегулярными и изношен. Переменная клетки могут присутствовать вблизи границы опухоли. В некоторых образцах, рядами опухолевых клеток может наблюдаться (рис. 3).
5. Cut мембраны с парой стерильными ножницами на границе лежащей против оболочки.
6. Поместите собраны CAM в стерильную чашку Петри с PBS, ^D или буфер дляформальдегид.
7. Сделать фотографией и верхнюю сторону и нижнюю сторону CAM, так и без фильтра.
8. Поместите мембраны в маркированный контейнер с буферном растворе формальдегида в течение по крайней мере 72 часов.
9. Вставить камеры в парафин и подготовить их для гистологического исследования. Позаботьтесь, чтобы вырезать трансплантаты опухоли в центре узелков, убедившись, что поверхность разреза параллельна нижней части кассеты. Если нет, то взаимодействие между CAM и опухоль трансплантат не будут видны. То же самое относится и к стратегии бляшек ECM гель: поверхности, обращенной к режущим лезвием должна быть перпендикулярна бляшки.

5. Гистологическое исследование

Гематоксилин-эозином и Ki-67 иммуногистохимию проводились для дальнейшего уточнения, если это необходимо. Иммуногистохимия проводили на фиксированных формалином парафин срезах тканей 3,5 мкм в толщину, с использованием автоматического слайд ситечко в соответствиис инструкциями производителя. Мышь первичный моноклональные антитела к Ki-67 (клон MIB-1, разбавление 1/100) был использован. Тепло-индуцированный Эпитоп поиск проводился с помощью мобильного кондиционирования 1 и визуализация была достигнута с Универсальный комплект обнаружения DAB, в соответствии с инструкциями производителя. Обезвоживание в срезах тканей проводили с использованием автоматизированной Coverslipper.

Для SAOS2 и SW1353 клеточных линий, количество Ki67-положительных и Ki67-отрицательные клетки nuclei/100 мкм ² подсчитывали в три зоны: один близко к границе CAM, одна закрыть поверхность и один в центре доска ECM геля. Эту процедуру повторяли 6 раз для каждого Ki-67 окрашенный препарат. Индекс пролиферации определяли для каждого слайда путем деления количества Ki67-позитивных клеток на общее число подсчитанных клеток.

Некроза определяется потерей тонкой дисперсии хроматина в ядре клетки, сопровождается Фадинг различных полей ячейки. Для ксенотрансплантатов, некроз оценивается как полные, частичные (часто на поверхности), или отсутствует. Проникновение опухолевых клеток в CAM определяется наблюдение опухолевых клеток в мезодерме CAM, и оценивается как присутствовать или отсутствовать.

Три пункта забил за хозяином поведение. Фибробластов инфильтрации определяется как удлиненные клетки оставляя CAM и вторжение опухолевых трансплантата / доска, и забил как присутствовать или отсутствовать. Сосудистые врастание может наблюдаться как врастание пролиферирующих цыпленок сосудов, характеризуется наличием ядерных эритроцитов цыпленка.

Результаты

Оценка CAM

Опухоль трансплантатов стать приверженцем CAM (рис. 2А). Одноклеточных суспензий от пациента материала часто отображают сушеные, слегка приподнятые бляшки (рис. 2D). После удаления CAM, отмечены складок мембраны происходит (рис. 2E и 2F).

Обсуждение

Время посева и сбора урожая

Выбор времени в день прививки проводили с использованием SAOS2 в ECM гель (36 CAM) и варьировались от день эмбрионального развития 5 и 10.

До дня инкубационного 9, кулачок не был последовательно умещаются гель ECM мы применили. В период сбор...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT