Синтез, Сотовый Доставка и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Применение датчиков рН Дендримеров основе

Резюме

Датчики флуоресценции являются мощными инструментами в области наук о жизни. Здесь мы опишем методику синтезировать и использовать дендримерных основе датчиков люминесцентные для измерения рН в живых клетках и в естественных условиях. Дендритных леса усиливает свойства сопряженных флуоресцентные красители, ведущих к улучшению свойств зондирования.

Аннотация

Развитие люминесцентных индикаторов представляет собой революцию в области наук о жизни. Генетически кодируется и синтетические флуорофоры с возможностями зондирования позволило визуализировать биологически соответствующих видов с высоким пространственным и временным разрешением. Синтетические красители представляют особый интерес благодаря их высокой управляемость и широкий спектр измеряемых веществ. Тем не менее, эти молекулы страдают некоторые ограничения, связанные с поведением малой молекулы (плохая растворимость, трудности в адресности, часто не логометрический изображений не допускается). В этой работе мы вводим развитие датчиков дендримерных основе и представить процедуру измерения рН в пробирке, в живых клетках и в естественных условиях. Мы выбираем дендримеров как идеальную платформу для наших датчиков для их многих желательных свойств (монодисперсности, настраиваемые свойства, многозначности), которые сделали их широко используется эшафот в течение нескольких биомедицинских устройств. Сопряжение люминесцентных рНпоказатели с дендримером эшафот привело к усилению их исполнений зондирования. В частности дендримеров экспонат снижается утечки клеток, улучшение внутриклеточного адресности и позволяют логометрических измерений. Эти новые датчики были успешно использованы для измерения рН в живых HeLa клетки и в естественных условиях в мозге мыши.

Введение

Использование флуоресцентных молекул маркировать определенные биологически-соответствующие молекулы полностью изменил способ, которым мы учиться биологических систем. Широкоугольный и конфокальной микроскопии позволило в режиме реального времени с высоким разрешением визуализации биологических процессов и в настоящее время являются одними из самых популярных методов для изучения биологических событий в пробирке, в клетках и в естественных условиях. ¹ Соответствующий улучшение представляли разработки показателей флуоресценции , т.е. красителей, флуоресценция зависит от концентрации специфического молекулярного лица. рН и кальция показатели, в частности, имел огромное влияние на изучении физиологии клетки из-за огромного актуальности ^{2 +} в биологии Н ⁺ и Ca. ^2,3

Тем не менее, большинство из красителей зондирования присутствующих несколько внутренние ограничения, связанные с их небольшой поведения молекул, таких как: I) трудности в субклеточной targetiнг; II) плохой растворимостью в воде и, следовательно, плохой биосовместимостью;. и III) утечка клеток и, следовательно, отсутствие долгого изображений возможностью покадровой ⁴ Кроме того, сигнал из множества зондов не может быть исправлена ​​в зависимости от концентрации красителя (не изображений пропорциональный) и, следовательно, абсолютное измерение в клетках или в естественных условиях невозможно.

Мы недавно описал простой и эффективной методологии преодоления этих ограничений, на основе сопряжения красителей зондирования на дендримеров эшафот. ⁵ Дендримеры Монодисперсные гиперразветвленные полимеры с очень привлекательных свойств для биологических применений. ⁶ В частности несколько дендритные архитектуры были разработаны и используются для приготовления ⁷ и доставки генов. ⁸ Только в самое последнее несколько групп начали исследовать потенциал этих молекул как эшафот для сенсорных устройств. ^9,10,11

Мы ранееописан простой путь синтеза по отношению к функционализации другой полиамидоамина (РАМАМ) строительные леса, основанный на NHS-активированных сложных эфиров. ¹² Конъюгаты могут быть получены в одну стадию путем диализа, как только очистки. Интересно этот подход может быть легко применена к различным дендритных или полимерных каркасов. ^13,14

Для достижения логометрических дендримеров изображений были дважды меченных с двумя наборами красителей: I) индикаторных рН (т.е. флуоресцеин) и б) рН-независимый флуоресцентный фрагмент (т.е. родамин). Это позволило выполнить точный изображений рН как отношение между флуоресцеин и родамин только зависит от рН и не более от концентрации зонда. Другой интересный подход к этому вопросу представлена ​​использования в течение жизни на основе зондов. ¹⁵ Как время жизни не зависит от концентрации зонда эти измерения не нужен логометрические коррекции. Тем не менее, LIFИзмерения Etime требуют более сложный инструментальную установки и их временное разрешение является оптимальным для быстрых физиологических процессов, тем самым ограничивая их возможности применения.

Для того чтобы выполнить внутриклеточного изображений, зонд должен быть доставлен через плазматическую мембрану в цитозоль. Поскольку дендримеры не проницаемой мембраны из-за их размера и гидрофильности, внутриклеточной доставки может быть достигнуто путем электропорации. С помощью этой методики, широко используемые в биологии для трансфекции, меченные макромолекулы могут быть эффективно доставлены в клетки, чтобы выполнить высокое качество изображения. Кроме того, при электропорации осложнений, связанных с дендримера эндоцитоза можно избежать как макромолекулы доставляется в цитоплазме. Интересно после электропорации различных дендримеров показывает различные локализации внутри клеток, даже в отсутствии каких-либо конкретных таргетирования последовательности. ⁵ этого Passivэ ориентации, только за счет физико-химических свойств дендримере, могут быть использованы для достижения органеллоспецифичными изображений рН.

Логометрический изображений можно выполнить с помощью конфокальной микроскопии. Флуоресцеин и родамин, ковалентно конъюгирован с дендритной строительных лесов, были отображены отдельно и пиксель-на-пиксель соотношение карта была создана. Несколько процедур по контролю внутриклеточного рН в живых клетках с помощью ионофоров не поступало. Ионофоры небольшие гидрофобные молекулы, способные транспортировать ионы через плазматическую мембрану; ионофоры для Н ⁺ ионов, таких как нигерицина, доступны и могут быть использованы для калибровки датчиков на основе дендримеров ¹⁶ Эти измерения показали линейную реакцию на рН аналогично тому, что наблюдалось. в пробирке. На основе калибровочной внутриклеточного рН может быть точно измерена. Эти измерения показали, что дендример основе датчика может быть ценным инструментом в исследовании Н ⁺ homeostASIS в живых клетках и патологических процессов, которые связаны сбои регулирования рН.

Недавно мы показали, что дендример основе датчики рН также может быть применен в естественных условиях, выполняя изображений рН в головном мозге анестезированных мышах. ¹⁷ Из-за сложной среде живых тканей высокого качества в естественных зондирования является технически сложной задачей. Здесь мы показываем, подробное описание экспериментальной процедуры в естественных условиях рН изображений с акцентом из важнейших вопросов, которые будут рассматриваться для выполнения точной визуализации рН в мозге. Двухфотонное микроскопии был принят на работу по двум основным причинам: я) использование инфракрасного света позволяет преодолеть отсутствие проникновения в ткани стандартного конфокальной микроскопии; II) широкий двухфотонного поглощения флуоресцеина и родамина позволит избежать их одновременное возбуждение осложнения, связанные с использованием двух длин волн возбуждения. измерения рН в мозге мыши былиуспешно проведены; датчики легко реагировать на гипоксию вызывают изменение рН в мозге внеклеточного пространства. Эти измерения показывают, что дендримеров на основе показателей может быть успешно использован для выделения физиологических и патологических изменение рН в естественных условиях в животной модели.

протокол

1. Синтез датчиков

1. В следующем разделе мы предлагаем процедуру сопряжения показателей рН в РАМАМ дендримеров. То же протокол может быть применен с минимальными изменениями в альтернативных дендримеров амин несущих. ^5,17,13,14 Коммерчески доступные дендримеров и красители могут быть использованы без дополнительной очистки.
2. Растворить дендример в безводном ДМСО (50 мкМ конечная концентрация). Подготовка 10 мМ исходные растворы флуоресцеина-NHS и тетраметил-родамина-NHS (ПМР) в безводном ДМСО.
3. Добавить к раствору дендримера нужное количество флуоресцеина и ПМР. Молярное соотношение в смеси будет отражать количество красителей, загруженных на дендримера. Обычно 1 мл G4-ПАМАМ-дендримера раствора в микроцентрифужных трубки подвергают взаимодействию с 8 EQ (40 мкл) флуоресцеина и 8 EQ (40 мкл) ПМР. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов.
4. Развести 1:10 деионизированной водой и загрузить реакциюСмесь в диализный мешок (MWCO = 10 кДа). Диализировать в течение 24 ч против деионизированной воды, заменяя часто воду в резервуар.
5. Переносят раствор во флакон и подвергают сублимационной сухой в течение 24 часов. Фиолетовый порошок должен быть получен. Вес полученного твердого вещества и растворить его в MilliQ воде до конечной концентрации 10 мкМ. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С.

2. In Vitro рН Измерения

1. Ибо в пробирке калибровки приготовить раствор 500 нм из дендримере в PBS (2 мМ фосфата) в кварцевую кювету. Использование очень разбавить PBS буфера (2 мм), чтобы избежать резких изменений рН в ходе титрования рекомендуется.
2. Измерьте спектры излучения флуоресцеина (отл 488 нм) и TMR (отл 550 нм) и оптимизировать оптические настройки флуориметре добиться хорошего отношения сигнал-шум.
3. Выполните рН титрование, добавляя небольшие объемы NaOH 0,1 н и HCl 0,1 N. После каждого добавления встряхнуть кюветудля смешивания, подождите 1 мин для уравновешивания и измеряют рН с помощью рН микроэлектрода. Спектры излучения флуоресцеина и ПМР должны регистрироваться для каждого шага без каких-либо изменений в оптических параметров.
4. Участок интенсивность флуоресценции против рН для титрования. Сигнал родамина не должны влиять рН (<10%). Сигнал флуоресцеина должен быть сигмоидальная кривая и должны быть оснащены одним связывания модели с PK = 6,4.

3. Культура клеток и Электропорацию

1. Выращивают клетки HeLa в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (Invitrogen). Держите культуры клеток при 37 ° С в увлажненной 5% CO ₂ атмосферы.
2. Для дендримера электропорации, когда клетки сливающийся, вынуть, и промыть клетки с помощью DPBS (Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором). Снимите DPBS и добавить трипсин-ЭДТА. Нейтрализовать Trypгрешить, добавив среду, содержащую сыворотку, но не антибиотики. Центрифуга при 900-1200 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре. Выньте материал и промойте гранул с помощью DPBS.
3. Граф клеток и взять 4 * 10 ⁶ клеток. Центрифуга при 1200-1500 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре.
4. Ресуспендируют клеточный осадок в 200 мкл microporation буфера (предоставленной microporator производителя) и передать клетки в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
5. Добавить дендример водного раствора в ресуспендировали клеток. Количество требуемого дендримера в образце зависит от типа ПАМАМ (обычно 250 нм для катионных и 2 мкМ для нейтральных дендримеров).
6. Добавить электропорации буфера (предоставляется microporator производителя) в microporation трубки. Внесите клетки и дендримеров смеси с электропорации оконечности 100 мкл объема размера. Вставьте microporator пипетку в пипетки станции. Установите условие импульса для microporation: импульсное напряжение = 1005 В; импульс WIDй = 35 мсек; число импульсов = 2.
7. После передачи импульсов клетки в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и центрифуги клеток течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту, чтобы удалить избыток дендримере в среде. Пластина 10 мкл электропорации клеток на 35 мм с прозрачным дном посуды (WILLCO блюдо GWSt-3522) свежей средой без антибиотиков.

4. рН зондирования в Жилая клеток HeLa

1. Клетки изображения с конфокальной микроскопии 12 часов после электропорации.
2. Стандартный набор фильтров для флуоресцеина и родамина могут быть использованы. Если настраиваемые фильтры доступны множество зеленый канал от 500 - 550 нм и красный канал от 580 нм до 650 нм. Возбуждение на 488 нм является оптимальным для флуоресцеина в то время как родамин могли быть отображены либо с 543nm или 561 лазерной линии.
3. Сосредоточьтесь на образец и настроить лазеры власть и детекторы получить максимально отношение сигнал-шум. Если электропорации был успешно клетки должны быть ярко флуоресцентный в обоих каналах.локализация зависит от размера и заряда используемого дендримера. Часто некоторые лизосомные локализации (небольшие перинуклеарные пузырьки) присутствует из-за эндоцитоза или раздробленности. Если локализация лизосомные преобладает, то есть большую часть флуоресценции локализуется внутри пузырьков и бедными сигнал наблюдается в цитоплазме, это означает, токсичность и измерения должны быть отброшены. Приобретать последовательно два канала, при необходимости приобрести несколько фотографий и усреднить изображения для улучшения качества изображения.
4. Для калибровки рН зажим клеток с использованием буфера с ионофоров при различных рН и получить по крайней мере 20 клеток на рН, как описано выше. Для более подробного описания процедуры и состав буферов см. Bizzarri и Коллеги. ¹⁶ Мы предлагаем для измерения по крайней мере 5 очков от рН = 5,5 до рН 7,5. рН ниже 6 являются токсичными для клеток, но терпимо для короткий промежуток времени, мы предлагаем приобрести изображения как можно быстрее. Если клеткидемонстрировать признаки апоптоза, отказаться от клетки и перезапустить.
5. Используйте ImageJ или аналогичное программное обеспечение для анализа данных. Импорт образы зеленого и красного канала, вычесть фон для создания пиксель за пикселем соотношении изображений с помощью инструмента "калькулятор изображения".
6. Нарисуйте область интереса (ROI) Выбор нужного ячейку и измерения внутриклеточного зеленый-в-красный соотношение. Анализ все изображения, полученные и затем участок соотношение по сравнению с рН. В диапазоне от 5,5 до 7,5 тенденция должна быть линейной. Линейный форме точек, полученных даст калибровочную кривую, которая будет использоваться для преобразования зеленый-к-красный соотношение к рН.
7. В качестве дополнительного контроля приобрести несколько необработанных клеток (не ионофоры) и попытаться вычислить рН с полученным калибровочной кривой. Значение между 7,2 и 7,4 должна быть получена.

5. В Vivo Подготовка образцов

1. Эксперименты проводились на C57Bl/6J (мужчины и женщины) между послеродовой гай 28 и 70. Под наркозом мыши путем внутрибрюшинной инъекции уретана (т.е. этил карбамата) (20% вес / объем в физиологическом растворе, 20 мг / кг уретана). Животных умерщвляли после эксперимента с передозировкой уретана, за которым следует внутрисердечной инъекции того же анестезией.
2. Выполнение внутримышечной инъекции дексаметазона натрия фосфата (2 мг / кг массы тела), чтобы уменьшить реакцию коры головного мозга стресс и отек мозга во время операции.
3. Бритье голову животного и применять 2,5% геля лидокаина на кожу головы.
4. Используйте ножницы, чтобы вырезать лоскут кожи, покрывающий череп обоих полушариях
5. Вымойте подвергается кость физиологическим раствором и осторожно удалите надкостницы с помощью щипцов. Это обеспечит лучшую основу для клея и зубным цементом придерживаться с.
6. Нанесите на заказ стали головной пост с центральным изображения камеры и приклейте ее с цианоакрилата в плоскости приблизительно параллельно с черепом над корковой области Iпроценты и зафиксировать его на месте с белым зубным цементом (Paladur).
7. Закрепите голову мыши, чтобы выполнить трепанации черепа 2-3 мм в диаметре, пробуренной над интересующей области.
8. Постарайтесь свести к минимуму нагрев коры во время операции, дуральных слез, или кровотечения.
9. Держите кору орошали стерильной ACSF (126 мм NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 1,3 мМ MgSO _4, 26 мМ NaHCO _3, 2,4 мМ CaCl _2, 15 мМ глюкозы, 1,2 ммоль HEPES в дистиллированной H ₂ O , рН = 7,4).

6. рН изображений в мозга мыши

1. В ходе эксперимента помощи дыхания животных, обеспечивающей O _{2-обогащенный} воздух. Кислород, обогащенного до 80%. O ₂ парциальное давление и поток часто регулируется для достижения правильного помощи дыхания. Поддерживать постоянную температуру тела при 37 ° С с обратной контролируется отопления одеяло.
2. Fix животное через стальную должности по цели двух-фотоНастройка н визуализации.
3. Для того, чтобы придать датчик в коре головного мозга загрузить стеклянную пипетку, содержащий электрод AgCl (диаметр наконечника 4 мм) с раствору дендримера (1 мкМ). Электрод позволит записывать внеклеточные потенциалы полей.
4. С установкой микроинъекции пипетки вставить в коре на глубине приблизительно 150 мкм. Введите в течение 1-2 мин при давлении 0,5 бар.
5. Оптимизация оптической настройки для работы с изображениями. Мощность лазера должна быть скорректирована, чтобы минимизировать фотообесцвечивания и фотоповреждения. Обычно мощность лазера используется около 20 мВт и ПМТ усиления оставалось постоянным и равным 667 V так как предыдущие калибровки показали, что это напряжение дает наилучшее соотношение сигнал / шум.
6. Для визуализации возбуждения датчика при 820 нм и обнаружить одновременно флуоресцеина и флуоресценции родамина через стандартные FITC и TRITC фильтров.
7. Для времени решены измерения приобрести временные ряды покадровой с частотой 2 Гц.
8. Для коррекции фон приобретают темно кадр с Ласег затвора закрыт для измерения среднего теплового шума, возникающего в ФЭУ и пьедестала обычно добавляются электроникой.
9. Для анализа данных следовать той же процедуре сообщается в разделе 4.

Результаты

На рисунке 1 показано схематическое представление конъюгации зондирования красители для различных дендритных лесов. Полученные показатели могут быть получены в одном удобном стадии синтеза из коммерчески доступных продуктов. Амин-дендримеры, имеющие подвергают взаимодейс?...

Обсуждение

Критические шаги для успешного рН изображений с датчиками дендримеров на основе являются: I) выбор правильного дендритной строительных лесов и количество показателей, конъюгированных с ним и б) оптимизация протокола доставки датчика в клетках или в естественных условиях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500