Получение мутантов Замедление, ускоренного и Обратный Старение в Honey Bee Model

Резюме

В пчелиных работников, старение зависит от социального поведения, а не на хронологический возраст. Здесь мы показываем, как рабочие-типы с очень разных форм старения могут быть получены и проанализированы на клеточного старения.

Аннотация

Обществ очень социальные животные имеют огромные различия продолжительности жизни между тесно связанных лиц. Среди общественных насекомых, пчел является лучшим создана модель для изучения, как пластичность в продолжительности жизни и старения объясняется социальными факторами.

Работник каста медоносных пчел включает пчел-кормилиц, которые имеют тенденцию выводок и измельчителей пчел, которые собирают нектар и пыльцу. Предыдущая работа показала, что функции мозга и летно-технические характеристики стареют быстрее, в фуражиров, чем у медсестер. Тем не менее, функции мозга могут восстановиться, когда комбайны вернуться к кормящих задач. Такие модели ускоренного и обратной функциональной старения связаны с изменившимися метаболических уровней ресурсов, чтобы изменения в белковой изобилии и иммунной функции. Вителлогенина, желток белок с адаптированными функций в гормональной и клеточной защиты может служить важным регуляторным элементом в сети, который управляет разную динамику старения в работников.

Здесь мы опишем, как появление медсестер и фуражиров можно контролировать, и манипулировать, в том числе обращения от обычно короткоживущих фуражиров в долгоживущих медсестер. Наши представительства результаты показывают, как люди с подобным хронологическим возрастом дифференцируются в фуражиров и пчел-кормилиц в экспериментальных условиях. Мы примером того, как поведенческая разворот от фуражиров обратно в медсестер может быть подтверждено. Последний, мы покажем, каким образом различные клеточное старение можно оценить, измеряя накопление липофусцина, универсальный биомаркера старения.

Для изучения механизмов, которые могут связать социальные влияния и старения пластичность, этот протокол обеспечивает стандартизированный набор инструментов, чтобы приобрести соответствующую образец материала, а также улучшить сопоставимость данных среди будущих исследований.

Введение

Сложные колонии структуры высоко социальные животные поддерживаются через взаимодействия репродуктивного касты, и помощник каста как правило, не воспроизводящих работников с различным поведением социальных задач. В разных рабочих, конкретные физиологическая адаптация включить различные поведения уходу Сиб, и также связаны с экстремальными различия продолжительности жизни. Медоносные пчелы и землекопы представляют наиболее развитых животных моделей для изучения, как социальность, связано с особенностями ускоряется, незначительным или обратить вспять старение ^1-3.

В пчелиных колоний, одна кладка яиц королева помогает тысяч рабочих, которые имеют тенденцию к выводка, корм для пищи, а также участвовать в охране, терморегуляцию или гигиенические поведения ^4. Из числа этих работников являются чрезвычайно короткоживущие комбайны, пчел-кормилиц с промежуточной и зима (diutinus) пчелы с длинными продолжительности жизни. Лица, однако, не являются постоянно привязан к определенной гореrker типа, но показать гибкую поведенческую онтогенез: они переходят из одной поведения социальной задачи на другую ("временные касты"). Кэллоу пчелы могут изменить в племенных тенденцию пчел-кормилиц, которые в конечном итоге может изменить к внешнему нагула. Однако неопытный гнезда пчелы могут также превращаться в самый долгоживущий зимних пчел, и короткоживущие комбайны могут даже вернуться в обычно долгоживущих медсестер. Работники с крайности (зимних пчел) и промежуточного соединения (пчел-кормилиц) продолжительность жизни имеют хорошо развитые пищевые производства и хранения органов с обильным ресурсов - в отличие от короткоживущих фуражиров (отзывы в ^1,5). Тем не менее, что регулирование индивидуальной продолжительности жизни выходит за рамки простых изменений в балансе ресурсов индивида можно судить по исследованиям на желтка белок, который имеет различные адаптированные функции в не-воспроизведения касты, такие как производство желе ^6, гормонального контроля ^7, иммунная ⁸ и антиоксидантное обороны ^9.

Модели Functional снижение (старение) зеркало продолжительность жизни неравенство среди работников, как это установлено для обоняния, а также для других мозговых или двигательных функций ^10-13. В частности, значительное снижение функции обучения только после двух недель поиска пищи соответствует аналогичный прогрессирование смертности в фуражиров ^14, в отличие от отсутствия обнаруживаемой упадка (незначительным увядания) в долгоживущих зимних пчел ^15.

Чтобы определить молекулярные отпечатки пальцев гибкой старения мы адаптированы установленные экспериментальные парадигмы, которые позволяют для мониторинга и управления переходами старения типа ^8,16,17. Эксперимент 1 детали, как получить образцы, в которых последствия хронологическим возрастом и работник типа конкретных социального поведения в области старения могут быть разделены. Эксперимент 2 описывает разворот фуражиров ускоренными в пчел-кормилиц с динамикой замедленных старения. Эксперимент 3 обеспечивает подход для зондирования эффекты клеточного старения на Anatomicaл количественное установленном биомаркеров для клеточного старения (липофусцина) ^18.

протокол

1. Развязка старения от хронологического возраста

В этом разделе описана настройка двойных колоний когорты, которые состоят из когорты выявленных лиц, которые разделяют ту же хронологического возраста ("одна возрастная когорта") и когорту гнезда пчел. Те же возрасте особи одного возрастной когорты, в конечном счете разделить на различных рабочих-типов с разной динамикой старения - это медсестра пчелы с замедлился, а добытчик пчел с ускоренным функционального спада. Все процедуры описаны в одной экспериментальной колонии. Мы советуем, однако, проводить эксперименты, по крайней мере два колонии репликатах так что эффекты колонии можно управлять для (двух реплик-дизайна).

1. Подготовка улей коробки для двойных колоний когорты: Подготовка одну очередную улей окно, которое получает две продуктовые гребни с медом, другой пищи расческу с пыльцой и две пустые соты. Убедитесь в том, чтобы найти повязана королеву, а также колонию доноров с более чем 3000гнездо пчел. Оба будут введены позже (1.3).
2. Получение и маркировки лиц с аналогичным хронологическим возрастом: Сбор гребни с герметичной выводок, который вот-вот появиться. С одной репликации ожидать собрать гребни с в общей сложности 3000-5000 печатного расплода клеток. Для каждого повторить использовать сбалансированное количество расплода, по крайней мере трех различных ульев источников, чтобы избежать перекос распределения материнских генотипов (улей происхождения).
   1. Поместите выводка гребни в инкубатор на 34 ° С с 60-70% относительной влажности. Убедитесь в том, чтобы сохранить гребни таким образом, чтобы новые выводок не может убежать.
   2. Пусть пчелы появляются в течение двух дней и отметьте эти пчелы с небольшой тега краски на грудную клетку (например, Uni Posca, Mitsubishi Карандаш Лтд). Цветовая метка позволит идентификации пчел на одной возрастной когорты (день возникновения), и отличить их от других повторных колоний.
3. Настройка двойной когорты колонию, которая включает в когорту Identified, пары Возраст пчелы: В день молодые пчелы были отмечены, собрать около 2500-3000 гнезда пчел из колонии доноров (сравните с разделом 1 в дискуссии.), и добавить эти немаркированные пчел в улей коробки, который был подготовлен ранее (см. шаг 1.1). Последние люди будут составлять неопознанный гнезда пчелы когорту.
   1. Добавить королеву, которая будет первоначально, ограниченный королевы клетке (приобретается отдельно). Уплотнение клетку с съедобного конфеты (например Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Германия), чтобы сделать рабочие пчелы медленно отпустите королеву.
   2. Добавить вновь возникших и отмеченные пчел, которая будет представлять собой единый возрастной категории. Эти пчелы являются только отмечены лица, и фокус-группы для всех следующих шагов.
4. Мониторинг нагула начало и маркировка комбайны: Для оценки возникновения и динамику перехода в одной возрастной когорты медсестра-на-собирателя, мониторинг демографической развитие нагула деятельности еочень днях для каждой колонии. Начните отсчет через пять дней после колонии были созданы (рис. 1).
   1. Подсчитать общее количество пчел, возвращающихся из нагула рейсы (вход отсчетов) в пределах 3 х 20 периодов мин наблюдения в определенное время. Убедитесь, что не в счет пчел в периоды ориентации полетов (см. Обсуждение).
   2. Когда входные рассчитывает указывают значительное нагула работа была начата (> 100 входные имп / день), начинают маркировки комбайны. Чтобы сделать это, комбайны из единого возрастной когорты (одиночные отмечены лиц) получает второе цветовая метка после возвращения из своих первых кормовых рейсов. Это цветовая метка будет указать день нагула начало, и позволит позже идентифицировать нагула возраст для каждого собирателя.
   3. Повторите ежедневные маркировку, пока достаточное количество пчел не было отмечено. Для оценки достаточное количество помеченных фуражиров, ожидать извлечения скорость не более 5-10% после эти пчелы были в возрасте, как правило, после 14 днейнагула.
5. Дискретизации: Так как все изначально отмечены пчелы имеют подобный хронологический возраст, подобранных по возрасту группы медсестер и старых комбайны могут быть собраны одновременно, когда комбайны уже промышляют в течение ≥ 14 дней.
   1. Холост отмечены медсестра пчелы собирают в улье, и идентифицируются поведения медсестер (подачи и очистки личинок с руководителями подавили в открытых выводка клеток).
   2. Двойные отмечены комбайны, также собираются в улье до начала ежедневно нагула деятельности.
   3. Сбор пчел в клетках (трубы, ящики), которые обеспечивают достаточную вентиляцию и не скрываться, пока дальнейшей обработки. Кроме того, для транскриптомных, эпигенетические или протеомических исследований, непосредственно замораживание оснастки пчел в жидком азоте. Сбор сбалансированные количества людей из всех зачетных группах и репликации колоний.

2. Восстановление рабочих с Rapid к-мигрантов с замедлился старения при смене Демография улья в

В этом разделе подробно описано, как разворот от работников с ускоренным старением (комбайны) для работников с замедленной старения (пчел-кормилиц) не выполняется. Такая поведенческая разворот индуцируется, когда комбайны испытывать нехватку пчел-кормилиц, которые обычно участвовать в заботы о потомстве. Процедура возвращение отделит одну колонию повторить на две ульев: один улей с медсестрой пчелы фракции ("медсестра происхождения"), и еще один с Forager фракции ("фуражир происхождения"). После успешного разворота, возможные симптомы пластика и обратить вспять старение может быть изучена в одной возрастной когорты с вернулась работников, продолжающих фуражиров, продолжая пчел-кормилиц и вновь набранных фуражиров. Как и прежде, выявленные пчелы единой возрастной когорты, а не когорты неизвестных гнезда пчел, составляют экспериментальную фокус-группу.

1. Приготовление: Репликация ульи с медсестер (одного отмечены) и фуражиров (дважды отмечен) были доступны, как описано в предыдущем разделе. Убедитесь, что не станут возвращение менее 500 отмеченных фуражиров в репликатов колонии, чтобы обеспечить достаточную выборку после возвращение была завершена.
   1. Для безопасной идентификации испытуемых группах после разворота очень важно, чтобы все население фуражир в оригинальной улья был отмечен от до возврата. Следующая процедура описана для одного репликации.
   2. За день до возврата, подготовить один дополнительный ящик улей для Forager полученных улья (см. шаг 1.1). Найдите две королевы и два выводка гребни из доноров ульев. Перед переходом на экспериментальных колоний смахнуть всех взрослых пчел из этих гребней. Один клетке королева (см. шаг 1.3) и один выводок гребень заменит королева и выводок гребни в оригинальной улья рамки. Другой набор королевы и расплода гребень будет использоваться на следующий день на новой коробке улья. Похожие выделение новых племенных расчесок и чужеродных королев для обоих, а оригинальная улей рекомендуется убедиться, что разделенные комбайны и медсестрас будет одинаково опыт изменил улей сигналы ("улей запах").
2. Реверсия: Утром, перед возвратом, добавьте клетке королеву и выводка гребень в новую коробку, которая получит долю Forager происхождения. Подождите, пока не начнется время пик нагула. Затем переместите оригинальный колонию с выраженными фуражиров и пчел-кормилиц, по крайней мере в 100 метрах от первоначального места.
   1. На прежнее место, настроить новую коробку для Forager полученных улья с выводком, и только королева.
   2. Foragers покинет вывих оригинальный улей окно, и возвратиться в исходное местоположение. Разрешить комбайны вернуться в исходное местоположение в течение 2 часов, чтобы достичь следующего полного разделения населения добытчик из гнезда пчел.
   3. Затем, чтобы прекратить разделение, закрыть оригинал, теперь "медсестра происхождения" улей, и передать его на пасеке, по крайней мере в 3 км.
3. Улей техническое обслуживание и мониторинг для успешной социальной задачиразворот: Проверьте экспериментальные ульи регулярно для здорового, открытого расплода.
   1. В течение первых дней после колонии манипуляции заменить без присмотра и мертвую выводок для снижения потенциального нагрузку патогена.
   2. Для проверки успешного разворот в Forager полученных улья, сфотографировать выводка расчесок до введения этих, и снова, когда гребни заменены или когда эксперимент возвращение завершена (рис. 2). Районы с ранее раскрытый расплода и с открытой, живой выводок надежные маркеры престарелых деятельности в Forager полученных колоний.
4. Дискретизации: Физиологические эффекты, которые сопровождают социальной разворот может быть обнаружено 3-8 дней после фуражиров и медсестер были разделены.
   1. Мы советуем пробовать все тестовые группы, т.е. убраны изменения рабочих и продолжающиеся комбайны (фуражир полученных улья), а также продолжающиеся медсестер и вновь завербованных комбайны (медсестра, полученных улья) через 8 дней после разворота инициируется.
   2. СедлоСобирайте образцы, как описано в шаге 1.5.

3. Анализируя работник типа Удельный клеточное старение шаблонов по количественной оценке липофусцина

Липофусцин является универсальным биомаркеров клеточного старения. В качестве внутренней продукта накопления, конкретных аутофлюоресценция липофусцина в _(макс. выбросов = 530-650 нм) могут быть использованы для обнаружения ^18.

1. Вскрытие и фиксация: Chill пчелы на льду до неподвижно; удалить и рассекать из нужного образца ткани.
   1. Передача в фиксаторе (4% параформальдегида в фосфатно-солевом буфере, PBS, рН 7,2) в течение инкубации в течение ночи при 4 ° С.
   2. Вымойте образцы 3 раза в PBS.
2. Обработка тканей и монтаж: Вырезать образцы ткани на секции с не более чем 40 мкм толщины, например, с помощью вибрационного лезвия микротом, например Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nußloch, Германия).
   1. Для очистки, инкубировать срезах тканей в течение ночи в 30% глицерине (PBS), и еще 2 часа в 50% глицерине (PBS).
   2. Установите разделы по предметных стекол в 50% глицерина (PBS). Для уплотнения длительного хранения крышка скользит с лаком для ногтей.
3. Получение изображений: Для обнаружения липофусцином, мы предлагаем с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, которая обеспечивает лазерные линии с λ = 514, 561nm или аналогичный для возбуждения, и с пропускной способностью детектор установлен на 570-650 нм.
   1. Для более точного определения липофусцина, включают в себя второй канал, и сделать одновременное сканирование на короткий спектров длин волн (возбуждение = 405 нм; выбросов = 410-450 нм). Чем дольше канала волны покажет как, гранулированный липофусцином, но и неспецифические "фон" в связи с autofluorescent трахеи и прочих гранулированных структур. Второй, более короткий канал длина волны будет только выявить неспецифическую аутофлюоресценция, но не липофусцин. Таким образом, идентификация липофусцин может быть Facili tated путем сравнения сигналов в обоих каналах, и только один из них выявления гранул с конкретной флуоресценции липофусцина.
   2. Для приобретения изображений с высоким разрешением использовать объектив с 40-кратном увеличении или выше, и предпочтительно числовой апертурой 1,25 или выше. Сканирование изображений складывается с размерами около 100 х 100 х 10 мкм ^3. Каждый человек и образец ткани должен быть представлен несколькими стеками изображения.
   3. Для снижения внутри-индивидуальную и меж-индивидуальные различия, вызванные технической вариации, всегда держите мощность лазера и постоянной чувствительности детектора.
   4. Чтобы уменьшить предвзятость, изо дня в день технических вариаций сканирования равное количество образцов всех опытных группах в каждом из нескольких сессий сканирования.
4. Обработка изображений: Используйте программные пакеты с модулями, которые позволяют по глубокой переработке микроскопических стеков изображения, например ImageJ (США Национальные Институты Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США,gej.nih.gov / И.Я. / "целевых =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Создайте 2D максимальную проекцию для каждого из 3D стеков изображения.
   2. Применение фильтра Гаусса со скромным размером ядра в целях смягчения высокочастотный шум, и, чтобы сохранить структуры с размерами липофусциновых гранул.
   3. Слияние обоих цветовых каналов для облегчения идентификации липофусцина (см. шаг 3.2).
5. Изображение анализы: Убедитесь, что предметом выполнения шагов количественной будет слеп, чтобы проверить групповую идентичность.
   1. Для всех изображений, сначала выбрать интересующую область (ROI), который охватывает соответствующие структуры, и имеет аналогичные размеры как трансформирования от других изображений.
   2. Затем выберите нужное количество липофусцина гранул, которые представляют каждый ROI. При выборе гранулы липофусцина в пределах рентабельности инвестиций, применение следующих правил снизит субъективизма.
      1. Выберите последовательный место для выбора первого Грануле. Это может быть, например, самый левый край ROI, и гранула, которая ближе к краю всегда будет первым выбор.
      2. Один за другим, гранулы выбраны, что ближе всего к предыдущему выбору (рядом сосед).
      3. При выборе следующего соседа, двигаться только в одном направлении, например, только поиск прямо из предыдущего выбора. Это правило предотвращает, что выбор преобладают случайные кластеров плотно упакованных гранул.
      4. Когда выбор сделан, оценить размер каждой липофусцина частицы, выделяя и измерения соответствующую зону гранул. Используйте соответствующие статистические тесты, чтобы сравнить особей разных зачетных группах.

Результаты

Протокол разделы 1 и 2 подробно, как испытуемые группы можно получить для изучения атрибуты ускоряется, замедляется и обратить вспять старение в колониях одной возрастной когорты. Для контроля работник типа дифференциации, которая сопровождает нормальную онтогенез мы оценивали измел?...

Обсуждение

Мы здесь принять описано ранее подходы ^{8,16,17,19,20,} и интегрировать их в единый рабочий процесс, который будет способствовать изучению гибкую старение в медоносных пчел. Наша цель заключается в предоставлении ученым, которые новичок в этой области со стандартизированным набор инстр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000