Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Резюме

Прижизненные микроскопия является мощным инструментом, который позволяет визуализации различных биологических процессов в живых животных. В этой статье мы представляем подробный метод визуализации динамику внутриклеточных структур, таких как секреторных гранул, в слюнных железах живых мышей.

Аннотация

Здесь мы опишем процедуру для изображений субклеточных структур в живых грызунов, которая основана на использовании конфокальной микроскопии прижизненной. В качестве модельной органа, мы используем слюнных желез живых мышей, поскольку они обеспечивают ряд преимуществ. Во-первых, они могут быть легко подвергается чтобы обеспечить доступ к оптике и стабилизированный, чтобы облегчить уменьшение артефактов движения, обусловленного сердцебиение и дыхание. Это значительно облегчает изображений и отслеживания небольших субклеточных структур. Во-вторых, большинство клеточных популяций слюнных желез доступны от поверхности органа. Это позволяет использовать конфокальной микроскопии, который имеет более высокое пространственное разрешение, чем другие методы, которые были использованы для естественных изображений, таких как двухфотонного микроскопии. Наконец, слюнные железы можно легко манипулировать фармакологически и генетически, обеспечивая тем самым надежную систему для расследования биологические процессы на молекулярном уровне.

В этом исследовании мы ориентируемся на протокол, разработанный, чтобы следовать кинетики экзоцитоза секреторных гранул в ацинарных клеток и динамики апикальной мембране, где секреторные гранулы сплавить по стимуляции бета-адренорецепторов. В частности, мы использовали трансгенных мышей, которые совместно выражает цитозольную GFP и мембраны, ориентированных на пептид, слитый с флуоресцентным белком тандем-помидор. Однако процедуры, которые мы использовали, чтобы стабилизировать и изображение слюнных желез может быть распространен и на другие модели мыши, и в сочетании с другими подходами к этикетке в естественных условиях клеточные компоненты, что позволяет визуализировать разных внутриклеточных структур, таких как эндосомах, лизосом, митохондрий, и актина цитоскелета.

Введение

В последние два десятилетия появление живой микроскопии и использование флуоресцентных белков привели к крупным прорывам на каждом клеточном процессе можно себе представить, тем самым развив наше понимание клеточной биологии ^1. Это поле извлекает огромную пользу от использования млекопитающих клеточных культур, которые являются чрезвычайно мощные модели системы, особенно когда дело доходит до экспериментальных манипуляций. Тем не менее, они не часто предоставляют истинное представление о биологии сложных многоклеточных организмов ^2. Этот вопрос начал решаться развития прижизненной микроскопии (ИВМ), который открыл дверь в расследовании ключевые биологические вопросы в таких областях, как нейробиологии, иммунологии и биологии опухолей ^3. До сих пор большинство исследований, основанных на IVM были выполнены на уровне тканей и отдельных клеток, не предоставляя никакой информации о динамике субклеточных отсеков. В последнее время наша лаборатория и другиес разработали методы КБПБ способные изображений субклеточных структур в живых грызунов ^{4-7, 13-15} и позволяющих фармакологические и генетические манипуляции в естественных условиях. Этот подход был использован нами для изучения торговлей мембраны в естественных условиях, и, более конкретно эндоцитоза и регулируется экзоцитоза ^6,7.

Наша экспериментальная модель система основана на разоблачения, стабилизирующие и визуализации подчелюстной слюнных желез (SGS) из анестезии грызунов. Выбор ИК качестве модели органа для IVM связано с тем, что железы были легко доступны, выполняя незначительные операции, может быть вовне без ущерба для их физиологию и стабилизированный, чтобы уменьшить артефактов движения из-за сердцебиение и дыхание. Кроме того, SGS может быть избирательно манипулировать генетически путем инъекции или вирусных или не-вирусные векторы, основанные через слюнной проток ^8,9. Наконец, SGS являются экзокринных желез, состоящие из поляризованного epithelial клетки, которые формируют ацинусы и протоки, миоэпителиальных клеток и сложную население стромальных клеток. По этой причине, они являются отличным моделью для изучения экзоцитоза, эндоцитоз, доставка генов, и актина цитоскелета, как подчеркивается в наших последних исследований ^10, и предлагают возможность изучить аспекты клеточной биологии, таких как клеточной полярности, деление клеток, клетки- сотовые узлы, и ионные каналы.

В этой статье мы подробно описать протокол изображений для достижения субклеточную резолюцию, в эпителии ИК живой мыши. В частности, мы покажем, как изображение секреторные гранулы в ацинарных клетках ПГ при регулируемом экзоцитоза. Как было показано ранее, при стимуляции с агонистов бета-адренорецепторов рецептора, секреторные гранулы сливаются с апикальной мембране и постепенно разрушаться, высвобождая свое содержимое в ацинозной канальцев ^6. Наша цель заключается в предоставлении основные инструменты для исследователей с тinimal опыт в хирургических процедурах и обработке животного, так что они могут успешно выполнять IVM на субклеточном разрешении. Поскольку наиболее сложной частью в IVM является подготовка животного, здесь мы сосредоточимся на описании основных хирургических процедур, которые используются для выявления и иммобилизации ГХ без ущерба для их функцию. Что касается процедур, чтобы маркировать субклеточных структур, несколько стратегий, таких как системной доставки флуоресцентных зондов, использование трансгенных животных, или сочетание того и другого, были описаны в других ^7,11.

протокол

Часть 1: микроскоп и Подготовка установки с изображениями

1. Любой перевернутой конфокальной микроскопии должны быть пригодны для IVM. В этом исследовании был использован Olympus IX81 Инвертированный микроскоп, оснащенный лазерной сканирующей конфокальной блока FluoView-1000. Для достижения наилучшего возможного разрешения, использование высоких целей Н.А., такие как водно-иммерсионной UPLSAPO 60x/1.20 Н.А., и масло погружения План-Апо 60x/1.42 NA рекомендуется. Цели масляной иммерсией имеют более высокую эффективность сбора и хотя они требуют использования покровным между тканью и цели, они обеспечивают более высокое качество изображений при использовании для областей изображения в пределах 15-20 мкм от поверхности. Кроме того, использование масла исключает заботу о испарения воды во время длительных сеансов визуализации. Для того чтобы поддерживать температуру и влажность, микроскоп должны быть полностью закрыты и снабжены теплой и увлажненном воздухе. Кроме того, животное, столик микроскопа, ицель должна быть нагрета с помощью других средств. Например, химические тепловые колодки могут быть использованы для животного и стадии, и специально разработанные объективные нагреватели могут быть использованы для цели (рис. 1А). Цель нагреватель должен быть включен 30 мин до начала процедуры. Примечание: когда тепловые колодки использование держать животное согреть марли должен поставить в между площадкой и кожей. Кожа должна контролироваться при ожогах.
2. Стандартные этапы большинство имеющихся в продаже конфокальной микроскопов имеют отверстие, которое используется для вставлять различные держатели, которые используются, чтобы соответствовать горки, чашки Петри, и тарелки разных размеров. Для того чтобы выполнить IVM, стандартный этап вставку в течение 35 мм чашки Петри переворачивают с ног на голову, покрытые 40 мм стекло, которое затем обеспеченного высокого вакуума силиконовой смазкой или клейкой лентой (рис. 1А). Пользовательский вставки также могут быть изготовлены из 3 мм толщины алюминиевой плите. Стеклянная поверхность является то клeaned с 70% этанола и сильно ударил с Kimwipe.
3. Производство индивидуальные держатель для иммобилизации SGS (стабилизатора). Цель держателя является стабилизация ЕСГ на месте и жестко пара их на сцену и покровного стекла. Держатель может быть выполнен из 60 мм пластиковой чашке Петри. Во-первых, в нижней части блюда разбивается от стен и нарезать прямоугольниками примерно 15 х 10 мм. Затем края закруглены и отполированы тонкой наждачной бумагой. Четыре распорки (1,5-2 мм) строятся путем удаления резиновые наконечники 1 мл шприцев плунжеров. С помощью тонкой шкуркой, поверхность прокладок и четыре угла пластиковой части полируются. Распорки затем приклеен с помощью желатиновой суперклей, а затем сглаживается тонкой наждачной бумагой на плоской поверхности. Обратите внимание, что для старых животных, размер держателей и распорки, возможно, придется увеличивать для размещения чуть больше желез.
4. Получение оптической связи геле. 0,3% Карбомер-940 (Табл. 2) гель получают путем разогрева 100 мл сверхчистой воды и растворения 5,47 г D-сорбита. Затем 0,3 г Carbomer-940 добавляются. Стакан должны быть покрыты и размещены на перемешивания горячей плите (низкую термостабилизации) в течение нескольких часов или пока все карбомер сгустки полного растворения. Наконец, Trietanolamine добавляется по каплям при осторожном перемешивании, пока рН около 7,4 не будет достигнута. Гель хранили при 4 ° С ^13.

Часть 2: Животные и Анестезия

1. Перед проведением каких-либо экспериментов с животными, протоколы должны быть одобрены локальном ухода за животными и комитета по этике. Важно отметить, что исследователи должны быть надлежащим образом подготовлены для выполнения хирургических процедур и должны проконсультироваться со своим местным комитетом по уходу за животными или учреждения ветеринаром, прежде чем приступить к процедуре.
2. В этом исследовании, модель мыши (GFP / mTomato-мышь), полученные путем скрещивания FVB мышей выражая растворимый GFP (GFP-мышь) шй C57B6 мыши, экспрессирующие мембранный с таргетингом пептид, слитый с флуоресцентным белком тандем-помидор (mTomato-мыши) ⁶ был использован. Примечание: он обычно принимает 20-30 мин для животного, чтобы стать полностью под наркозом и нацелен для работы с изображениями
3. Мыши размещены в контролируемой среде на объекте животного и могут акклиматизироваться в течение одной недели до эксперимента. Этот шаг необходим для работы с изображениями, SG, так как никаких результатов бедствия в расширенной секреторной активности ^12. Вода и продовольствие предоставляются без ограничений. Мужчины от 2 -5 месяцев старых используются для экспериментов с изображениями (20-30 г).
4. До анестезии, взвесить животных, чтобы определить правильную дозу анестетика.
5. Так как стресс, вызванный введением инъекций анестетиков может ухудшить секреторную активность SGS, индуцировать анестезию предварительно по изофлуран ингаляции, после чего инъекции анестетиков. С этой целью разместить мышей очень осторожно в испаритель камеры ивключите потока кислорода (800-900 мм рт.ст.). Установите изофлураном уровни до 3%, чтобы начать индукцию предварительно анестезии.
6. После того, как животные сознания, вводят смесь 100 мг / кг кетамина и 20 мг / кг ксилазина в брюшную полость (25 г иглы). Анестетики свежеприготовленный разбавлением 100 мг / мл ксилазина до 20 мг / мл в физиологическом растворе, а затем смешивание ее с кетамина. Эту смесь дополнительно разбавляют 1:01 физиологическим раствором и соответствующее количество вводят в расчете на массу животного. Это разбавление помогает в предотвращении случайной передозировки. Следует отметить, что смесь теряет свою эффективность после 20 мин.
7. Соблюдайте животных на наличие признаков бодрствования и придать больше обезболивающий смесь, если они выходят из наркоза (приблизительно 75% начальной дозы в течение 45 мин после первой инъекции, а 50% каждый час после этого). Проверьте глубину анестезии каждые 15 мин, зажимая лапу и наблюдения за ответ. Примечание: Всегда управлять глазной мази для предотвращениясухости глаз.
8. Анестетики вызывают гипотермию, которые могут повлиять на воспроизводимость экспериментов и здоровье животного. Поэтому, мыши должны храниться под инфракрасной лампой или на нагретой площадкой для всей продолжительности эксперимента. Примечание: инфракрасная лампа должна быть не менее 12-18 см от животного, чтобы предотвратить горение
9. Температура тела животных должен контролироваться с помощью термометра, снабженный ректального датчика температуры.

Часть 3: Животное хирургии и позиционирования для прижизненной микроскопии

1. Подготовьте рабочее место со всеми хирургических инструментов (табл. 1), которые должны быть чистыми и стерильными.
2. Бритье области шеи мыши с электрическим клипера. Протрите брюшной стороне области шеи из анестезированной мыши с марлевой губкой, смоченной в 70% этанола. Высушите избыток с Kimwipe.
3. С тупой изогнутые пинцеты поднять небольшой кусочек кожи по срединной линии (приближениисчете на нижнем конце жевательных мышц), и делают небольшой разрез (рис. 1b).
4. Вставьте ножницы в отверстие и отделить кожу от подлежащих тканей, открыв лезвия ножниц. Избежать повреждения основной железистой ткани, указывая ножницы вверх к нижней части кожи. Повторите этот шаг несколько раз, пока кожа не отделяется от более глубоких тканях (рис. 1b).
5. Используя ножницы, вырезать полоску ослабил кожи шириной около 3 мм и длиной 10 мм. Кожа должна быть обрезаны так, чтобы отверстие начинается около основания ИК где нерв, канал и кровеносные сосуды соединяют железу к остальной части тела. После очистки области раны, в результате открытия будет овальной формы и измерения примерно 8 х 12 мм. Оба SGs будут видны после открытия (рис. 1В).
6. С помощью шприца применять для оптической связи гель в середине разреза и уничтожить его квне стерильной марли. Чистые куски марли должен быть использован для каждого стереть, чтобы предотвратить введение волос или крови в открытой ткани. Повторите этот шаг, пока все в крови и распущенные волосы не будет удален.
7. Использование # 7 пинцет, отделить соединительную ткань вдали от правой подчелюстной железы на всем пути к основанию железы (в качестве альтернативы этот протокол может быть использован на левом ПГ). Во-первых, найти кончик SG и захватить соединительной ткани на несколько миллиметров выше кончика железы. Tear соединительной ткани вокруг железы без повреждения паренхимы. (Фиг.1В). После того, как железа подвергается, мягко отдельные соединительную ткань от железы. Если кровотечение происходит, смыть кровь от физиологическим раствором. Убедитесь, что все соединительные ткани разделяют и железа полностью открыты. Держите железу влажная, применяя оптический соединительный гель регулярно.
8. До чего животное к микроскопу, разместить толстый кусок марли и УВОт пакет на столике микроскопа, чтобы поддерживать температуру 38 ± 2 ° С. Температура химический тепловой пакет можно регулировать размером разрезов, которые предоставляют внутренний мешок в атмосферу. Марля обеспечивает некоторую изоляцию тепла колодой из стадии металла. Крышка в верхней части теплового пакета с тонким кусочком марли, а также.
9. Место животное на бок (правая сторона для правой железы) и на марлю. Поместите животное с подчелюстной слюнной железы, помещенной в середине покровного стекла (рис. 1в).
10. Животное должно быть надежно закреплены и стабилизировалась на этом посту до иммобилизации железу. Место кусок липкой лентой на брюшной стороне передней правой лапы мыши. Крюк резцы мыши шелковым швом (рис. 1в, вставка). Создание некоторую напряженность между шелковой нити и лапы и прикрепить их на сцену на липкой лентой. SG должен отдыхать, естественно, в серединепокровное. Голова и грудная клетка должна быть дополнительно стабилизированы пластмассовых клиньев, которые могут быть соединены на сцену.
11. Поместите небольшой кусочек для чистки линз ткани над железы (рис. 1в). Расширение железы немного и поместить настроенный держатель на железе. Плотно пара стабилизатор на сцену с помощью клейкой ленты. Муфта может быть улучшена с помощью металлического зажима, соединенного с этапа (рис. 1в). Натяжные и острые углы следует избегать, поскольку они могут поставить под угрозу кровоток. Сразу после стабилизации осмотреть кровоток либо путем изучения железу визуально (она должна сохранить розовую окраску) или эпифлуоресцентной. В GFP / м-томатным мыши, валовые изменения кровотока могут быть легко оценены так как и кровеносные сосуды и некоторые из клеток крови помечены м-помидор.
12. Крышка животное марлей и нагретой прокладки. Измеряют температуру открытой железы с помощью термометра оборудованный WIth небольшой гибкий зонд термопары в контакт с одной стороны открытой железы.

Часть 4: Параметры обработки изображений

1. Использование эпифлюорисцентной подсветки фокуса на поверхности железы, или с помощью GFP или набор RFP фильтра. Найти поверхность SG, и оценить кровоток в капиллярах и общую морфологию ткани. Признаки повреждения тканей включают мембранный блеббинг или появление крупных вакуолей.
2. Оценка стабильности ткани или через эпифлуоресцентной или предварительного сканирования выделенную область. Стабильная подготовка имеет важное значение, так как большинство артефактов движения не могут быть удалены или исправлены для анализа данных постобработки. Если препарат не является стабильным, корректировки не требуется.
3. Чтобы найти правильный фокальной плоскости имидж желез в режиме предварительного сканирования (1X зум), и постепенно двигаться цели к покровным до ацинарных структур, секреторных гранул и рLasma мембраны становятся отчетливо видны (рис. 2).
4. Параметры обработки изображений для покадровой зависеть от конкретного эксперимента. Чтобы изображение динамика секреторных гранул использовать скорость сканирования 0,5-2 сек / кадр, и 256 х 256 пикселей с 0,2 мкм / пиксел пространственного масштаба (поле зрения примерно на 50 мкм х 50 мкм). Для того, чтобы оптимально визуализировать гранул и плазматическую мембрану, оптическая толщина должна быть установлена ​​между 0,9-1,2 мкм. Для возбуждения GFP и тандем-томат, можно использовать длину волны 488 нм и 561 нм соответственно. Пиковая мощность устанавливается вокруг 0,5 мВт для 488 нм и 1 мВт для 561 нм. Это обеспечивает минимальное фотообесцвечивания.
5. Настройки детектора должны быть скорректированы для поддержания сигнала в пределах динамического диапазона и зависят от яркости образца.
6. После того как все параметры заданы, визуализация может быть запущен. Во-первых, снимок поле зрения, который будет использоваться в качестве точки отсчета. В то время какизображений в промежуток времени, дрейфующих из ткани в XY и Z может произойти. Это может быть компенсировано вручную регулировать область сканирования и положение Z. Корректировки должны быть сделаны постепенно и небольшими порциями, чтобы избежать артефактов. Кроме того, опорное изображение может использоваться для определения того, происходит ли фотообесцвечивание. Если значительная фотообесцвечивание обнаруживается (снижение более чем на 15-20% флуоресценции), уменьшить мощность лазера на 0,1 мВт.
7. Чтобы стимулировать экзоцитоз, вводят подкожно 0,1 мг / кг свежеприготовленного раствора изопротеренола в физиологическом растворе. Экзоцитоз срабатывает приблизительно через 1 мин после инъекции. Секреторных гранул слияния с плазматической мембране будет обнаружен увеличением флуоресценции GFP вокруг гранул и диффузии пептидов тандем-томатов в их предельных мембран (рис. 3). Мы рекомендуем приобретать 3-4 покадровой последовательности в том же районе, 10 мин каждый.
8. После сессии изображений, усыпить АНХsthetized животное по CO ₂ ингаляции в эвтаназии камеры (10-12 мм рт.ст. в течение 10 мин).

Результаты

В GFP / mTomato мыши, ацинусы видны менее отчетливо различные структуры, которые выражают цитозольную GFP и мембраны, ориентированных на тандем-Томатный пептид (рис. 2, ломаную). В индивидуальном ацинусов, ацинарные клетки очерчены пептида тандем-томатным. GFP также обнаружены в ядрах, к...

Обсуждение

Пока субклеточные структуры были отображены в основном в в пробирке (т.е. клеточные культуры) или в бывших естественных условиях (то есть орган-культур, срезы тканей, ацинарные препараты) модельных систем, которые часто не повторять характеристики неповрежденных живых тканей ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476