JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Жировая ткань (AT) является объектом интенсивных активации иммунной клетки и взаимодействия. Почти все клетки иммунной системы, которые присутствуют в AT и их отношения меняются от ожирения. Правильная изоляция, количественное определение и характеристика AT иммунные клеточные популяции имеют решающее значение для понимания их роли в immunometabolic заболевания.

Аннотация

Открытие увеличился инфильтрации макрофагов в жировой ткани (AT), страдающих ожирением грызунов и человека привело к усилению интереса к иммунной клетке вклад местных и системных резистентность к инсулину. Выделение и количественная оценка различных иммунных клеточных популяций в худых и тучных AT сейчас обычно используются в технике immunometabolism лабораториях, однако особую осторожность должны быть приняты как в стромальных сосудистой изоляторе и в анализе проточной цитометрии, так что полученные данные надежно и интерпретируемых . В этом видео мы покажем, как фарш, переварить, и изолировать иммунных клеток обогащенного стромальных сосудистой фракции. Впоследствии мы покажем, как антитела этикетке макрофагов и Т-лимфоцитов, и как правильно на них ворота в экспериментах проточной цитометрии. Представитель проточной цитометрии участков из низким содержанием жира и мяса и кормили с высоким содержанием жиров кормили мышей ожирением предоставляются. Важнейшим элементом этого анализа является использование антител, которые делаютне флуоресцирует в каналы, где AT макрофаги естественно аутофлуоресцентной, а также использование надлежащего контроля компенсации.

Введение

Исторически сложилось, что жировая ткань (AT), рассматривается в качестве инертного орган накопления липидов, который расширяется и сжимается в зависимости от энергетического баланса. Теперь мы понимаем, что AT представляет собой динамическое эндокринный орган, активно выделяет ряд гормонов, которые непосредственно влияют на пищевое поведение и системного гомеостаза глюкозы. Кроме того, в течение последнего десятилетия наблюдается увеличение признательность за многочисленные популяции иммунных клеток, проживающих в AT стромальных сосудистой фракции (НВФ), а также их вклад в AT гомеостаза.

Возможность отделить AT адипоцитов и СФДВ использованием коллагеназы дайджест последующим дифференциальным центрифугированием был впервые описан в 1964 году Родбелл 1. Коллагеназа II чаще всего используется для адипоцитов и SVF разделения за счет поддержания адипоцитов рецепторы инсулина 1. Уже на раннем этапе ферментативного фракционирования AT в основном используются для изучения ADIPOцит метаболизма и изолировать преадипоцитов. Совсем недавно, этот метод, в сочетании с широкой доступности потока цитометрах и постоянно растущего количества коммерчески доступных флуорофором антителами, способствовала характеристика AT иммунных клеток.

Хотя присутствие иммунных клеток в воспаленных AT было описано ранее 2, семенных работ Weisberg соавт. Сюй и др.. опубликованной в 2003 г. первым документом накопления AT макрофагов (ATM) в ожирение, которые секретируют цитокины и коррелируют с AT-специфический и системной инсулинорезистентности 3,4. Эти наблюдения послужили основой новой области исследования недавно придумали, "immunometabolism", 5 и были последовать исследования причастности различных иммунных клеточных популяций, в том числе 6 дендритных клеток, тучных клеток 7, 8 Т-клетки -10, В-клетки 11, 12 NKT клетки, эозинофилы 13, 14,15 и нейтрофилов в развитии ожирения связана резистентность к инсулину.

Цель этой статьи заключается в предоставлении подробное описание техники коллагеназе дайджест использованы для выделения клетками AT SVF и охарактеризовать атм и Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Этот протокол был оптимизирован для мыши AT, однако зрители могут извлечь пользу из чтения отличную статью, предусматривающую подробностях по оптимизации этой техники для человека в 16 лет. Целевая аудитория этой статьи содержится следователей с ограниченным опытом работы с мышью и выполнение проточной цитометрии. Несколько практических соображений для балансировки сотовой урожайности и жизнеспособности со временем и ресурсами представлены, а также оптимальных управлений проточной цитометрии для характеристики AT иммунных клеточных популяций. В дополнение к нашему протоколу, читатели referrED В недавней статье на Юпитер Басу и др.. для отличной обсуждение некоторых технических аспектов проточной цитометрии включить надлежащего контроля и компенсаций 17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Реактивов и расходных материалов

До начала этого экспериментального протокола, подготовить следующие реагенты:

  1. 70%-ном этаноле
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBS (без Са и Mg) с добавлением 0,5% BSA
  4. FACS буфера: 1х DPBS (без кальция и магния), 2 мМ ЭДТА и 1% FCS
  5. ACK буфер: 150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО3, и 0,1 мМ Na 2 ЭДТА в воде

2. Сбор и подготовка жировой ткани

  1. Усыпить мышей в соответствии с IACUC утвержденные процедуры, характерные для каждого учреждения.
  2. Тщательно намочите меха с 70% этанола.
  3. Сделайте надрез на уровне мечевидного отростка (нижняя часть грудины) и откройте грудную полость, чтобы открыть сердце, стараясь не разорвать любые крупные кровеносные сосуды.

Примечание: На данный момент, это также полезно, чтобы оставить мембраны нетронутым каквозможно, и сократить паз из правой стороны грудной клетки, чтобы позволить крови и перфузату вытекать из грудной полости.

  1. Клип правое предсердие, чтобы позволить крови и перфузат избежать кровеносной системы.

Примечание: При работе с тучных мышей, избыток перикарда AT возможно, должны быть удалены, чтобы разрешить доступ к сердцу.

  1. Возьмитесь за сердце пинцетом и аккуратно вставьте иглу в левый желудочек через вершину. Медленно заливать мышь с 15 мл стерильного PBS.

Обратите внимание: Снизить коэффициент перфузии если легкие начинают заполнять и расширяться.

  1. Откройте брюшную полость и удалить жировые отложения perigonadal использованием осторожность, чтобы избежать любых половых тканей.
  2. Наведите жировых отложений на вес лодки на льду, содержащую 2 мл 1X DPBS (без Mg или Са) с добавлением 0,5% BSA, и фарш AT на мелкие кусочки.

Примечание: предельная сумма AT за лодкой весят до 1,2 г. Если количество AT превышает 1,2 г, разделить его поровну между двумя весят лодки.

  1. Хранить при образцы на льду и подготовить 3 мл коллагеназы дайджест раствора на AT образец, состоящий из 1X DPBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 10 мМ CaCl 2 и 4 мг / мл коллагеназы типа II.

3. Коллагеназой

  1. Передача AT до 50 мл конические пробирки путем выливания гомогената и промывка весят лодке с 1 DPBS мл (0,5% BSA) и 3 мл коллагеназы II дайджест решение.
  2. Инкубируют при гомогената в ротационном шейкере (200 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 20 мин.
  3. Добавить 10 мл DPBS (0,5% BSA) в конические пробирки и место на льду.
  4. Растирают гомогенат много раз с использованием 10 мл серологические пипетки, и передать через клеточные суспензии 100 мкм фильтр в новый 50 мл коническую трубку.
  5. Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 10 мин при 4 & Dнапример, C.
  6. Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в 3 мл ACK буфера для лизиса загрязняющих эритроцитов.
  7. Добавить 12 мл FACS буфера и подвески центрифуги клетки при 500 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
  8. Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в буфере FACS.

Примечание: Используйте размер осадок клеток в качестве руководства для сколько FACS буфера для ресуспендирования дюйма Если осадок клеток охватывает нижнюю часть 50 мл коническую трубку, использовать 0,5-1 мл FACS буфера, в противном случае, ресуспендируют в 0,25-0,5 мл.

  1. Место образцы на льду и подготовить 1:10 разбавление аликвоты каждого образца для подсчета клеток путем смешивания 40 мкл FACS буфера, 50 мкл раствора трипанового синего (0,2%) и 10 мкл суспензии клеток.
  2. Граф жизнеспособных клеток на основе исключения трипанового синего и разбавленной суспензии клеток в конечной концентрации 5-10 × 10 6 клеток / мл.

4. Окрашивание клеточных поверхностных антигенов

  1. Добавить анти-мышь CD16/CD32 антитела (Fc блока) до конечной концентрации 0,5-1 мкг/10 6 клеток и инкубировали на льду в течение 10 мин.
  2. Передача образцов (≥ 10 6 клеток) до 12 х 75 мм полистирольные пробирки с круглым дном. Подготовить отдельные трубы, если анализ банкоматов и Т-клетки, и объединить дополнительные клетки для подготовки достаточного количества труб для размещения требуемой компенсации и модифицированных флуоресценции минус один (FMO) управления.

Примечание: В качестве примера, когда количественное соотношение банкоматов на основе F4/80 и CD11b, следующие компенсации и предприятия управления должны быть подготовлены:

- Необработанный (ячеек)

- DAPI или пропидий йодида (PI) одно пятно (клетки, никогда не добавляйте краситель жизнеспособность до шага 5.1)

- F4/80 APC одного пятна (ячейки или компенсации бисера)

- CD11b FITC одно пятно (клетки иликомпенсации бисера)

- Предприятию 1 (ячеек): Крыса IgG2a κ изотипом управления APC + CD11b FITC + жизнеспособность красителя (добавлено на шаге 5.1)

- Предприятию 2 (клеток): F4/80 APC + Крыса IgG2b κ изотипический контроль FITC + жизнеспособность красителя (добавлено на шаге 5.1)

  1. Добавить флуорофора конъюгированных первичных антител и / или изотипа управления в соответствующей концентрации (см. таблицу реагентов и материалов).
  2. Защитить образцы от света и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин.
  3. Добавить 2 мл FACS буфера и подвески центрифуги клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
  4. Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в 2 мл буфера FACS.
  5. Центрифуга клеточной суспензии 500 х г в течение 5 мин при 4 ° С, и ресуспендируют СФДВ осадок клеток в ≥ 400 мкл буфера FACS.
  6. Передача образцов до 12 х 75 мм полистирола с круглым дном трубках, оборудованных 35 мкм ячейки фильтра вершины трубы.
  7. Не Беречь от света, и хранить образцы при 4 ° С до анализа FACS.

Примечание: Для достижения оптимальных результатов клетки должны быть проанализированы immeadiately, однако FACS-анализ с этим протоколом был успешно проведен меченых клеток сохраняется в буфере FACS в течение 1-2 часов при 4 ° С. Если клетки должны быть установлены для увеличения срока хранения, меченые клетки могут быть исправлены с 2% параформальдегида при 4 ° С в течение 24 ч до анализа FACS. Антитело компании предполагают, что меченые клетки можно хранить в течение одной недели, однако это не была испытана в контексте этой процедуры.

5. Анализ FACS

  1. Перед анализом FACS, добавьте краситель жизнеспособности образцов и соответствующие управления, чтобы обеспечить Live / Dead Cell дискриминации.

Примечание: многочисленные красители жизнеспособности имеются в продаже, но и PI DAPI рекомендуются в зависимости от возбуждения / испускания профИлес из флуорофора конъюгированных антител используется. DAPI и пропидия иодида для каждого образца при конечной концентрации 0,2 мг / мл.

  1. Использование неокрашенных отрицательного контрольного образца, предпочтительно клетки, выделенные из той же ткани, как экспериментальные образцы, для регулировки бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC), так что популяция клеток (ы), представляющие интерес находятся на шкале.

Примечание: Для анализа AT SVF клетки, рекомендуется SSC быть отображены в логарифмической шкале по сравнению с FSC в линейном масштабе. Использование логарифмической шкалы для SSC особенно важно при анализе банкоматов, которые часто являются очень большими и зернистая.

  1. Нарисовать начальный ворота рассеивать свет на основе типа клеток (ы) анализируются, и отрегулировать фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) коэффициент усиления таким образом, что неокрашенные клетки находятся на крайней левой части одного параметра гистограмма (примерно по центру 10 +2) для соответствующих каналов.

Примечание: Рекомендуется, чтобы лимфоциты и макрофаги (или других клеток миелоидного) быть проанализированы отдельно из-за различий в аутофлюоресценция.

  1. Используйте одинарные окрашенных управления или антитела бисера захвата возмещения выполнять многоцветные компенсации.

Примечание: Использование компенсации бусы рекомендуется, однако совместимость каждого антитела должны быть обеспечены. Например, компенсация шариков не может перекрестную реакцию с кроличьими антителами, в этом случае изолированных клеток, необходимых для получения соответствующего одного пятна управления.

  1. Установить экспериментальные ворота на основе модифицированного управления предприятием.
  2. Установите проточной цитометрии для сбора соответствующего количества событий на основе распространенности население интерес и записи экспериментальных данных.
  3. Экспорт данным ФТС файлы для автономного анализа. Есть множество программ, доступных для потока cytometrY анализа данных. Мы рекомендуем Cytobank, веб-платформа, которая позволяет investigatores для хранения и анализа данных и создания цифры с любого компьютера с доступом в Интернет 18. Кроме того, Cytobank дает возможность сделать данные доступными общественности или ограничить доступ к коллаборационистов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Коллагеназой АТ с последующим дифференциальным центрифугированием, используемый для изоляции СФДВ из придатка жировой ткани самцов мышей C57BL/6J подается с низким содержанием жира (10% ккал за счет жира) или с высоким содержанием жиров (60% ккал за счет жира) диету (ЛФД и HFD соответственно) в ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Растущий интерес к роли иммунной системы в метаболических последствий ожирения привело к широкому использованию проточной цитометрии, чтобы охарактеризовать иммунные клетки АТ. Хотя точный протокол будет варьироваться между лабораториями на основе их собственного опыта и имеющего?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

JSO поддерживается NIH Рут Л. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), А. К. поддерживается Докторантура стипендий от Американской Диабетической Ассоциации (7-10-МИ-05), а АНН поддерживается Американской кардиологической ассоциации, созданной Награда Исследователя (12EIA8270000). Эксперименты проточной цитометрии проводили в проточной цитометрии VMC общему ресурсу. VMC проточной цитометрии общий ресурс поддерживается пищеварительной Вандербильта Болезнь научно-исследовательский центр (DK058404).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 mlLife Technologies14190-250
DAPILife TechnologiesD3571
BSASigmaA2153-100G
collagenaseSigmaC6885-5G
propidium iodide solutionSigmaP4864-10 ml
stable stack 20 microliterRaininSS-L10
20 microliter filter tipsRaininSRL10F
stable stack 250 microliter tipsRaininSS-L250
1000 microliter tipsRaininGPS-L1000
1000 microliter filter tipsRaininGP-L1000F
250 microliter Filter TipsRaininSR-L200F
FC BlockBD Biosciences553142
fisher 100mn strainersFisherbrand22-363-549
medium weigh dishFisherbrand02-202B
aluminum foilFisherbrand1213100
mincing scissorsFisherbrand089531B
VortexFisherbrand2215365
50 ml conical tubesBD Falcon14-959-49A
filter top FACS tubesBD Falcon352235
10 ml pipette case 200BD Falcon1367520
round bottom tubesBD Falcon352058
5 ml syringeBD Falcon309646
V Bottom PlatesCostar07-200-107
transfer bulb pipetteThermo Scientific13-711-22
ShakerThermo Scientific11 676 071
Adhesive matThermo Scientific1368750
Cell Culture CentrifugeSorvall75253839
AdaptersSorvall75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32BD Biosciences553142Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80eBioscience17-4801Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11beBioscience11-0112Fluorophore conjugate: FITC
Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11ceBioscience12-0114Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2R&D SystemsFAB4297PFluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206R&D SystemsFAB2535PFluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2R&D SystemsFAB5538PFluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβBD Biosciences553174Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8aBD Biosciences552877Fluorophore conjugate: PE-Cy7
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4BD Biosciences557956Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 557963

Table 1. List of Materials and Reagents.

Ссылки

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
  3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
  4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
  5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).
  6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
  7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
  8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
  9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
  10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
  11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
  12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
  13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
  14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
  15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
  16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
  17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
  18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).
  19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
  20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

75ATFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены