Доклинические Оценка тирозинкиназы ингибиторов для лечения острого лейкоза

Резюме

Рецептор тирозинкиназы эктопически выражается в многих видов рака и были определены в качестве терапевтических мишеней в острый лейкоз. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ингибиторами тирозинкиназы для лечения острого лейкоза.

Аннотация

Рецепторные тирозинкиназы были вовлечены в развитие и прогрессирование многих видов рака, в том числе как лейкемии и твердых опухолей, и являются привлекательными druggable терапевтические мишени. Здесь мы опишем эффективную стратегию из четырех шагов для доклинической оценки ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) в лечении острых лейкозов. Первоначально вестерн-блот анализ используется для подтверждения целевого торможение в культивируемых клеток лейкемии. Функциональная активность затем оценивали с помощью клоногенные анализов в метилцеллюлозы или мягких агара культур. Экспериментальные соединения, которые демонстрируют активность в клеточных анализов культуры оцениваются в естественных условиях с использованием NOD-SCID-гамма (НСГ) мышей пересаженных ортотопически с линиями клеток лейкемии человека. Первоначальные в естественных условиях фармакодинамических исследования оценки целевой ингибирование в лейкозных бластов, выделенных из костного мозга. Этот подход используется для определения дозы и схемы введения, необходимое для эффективного целевой Блокировкаионная. Последующие исследования оценить эффективность ИТК в естественных условиях с использованием люциферазу выражающее лейкозных клеток, что позволяет для неинвазивного биолюминесцентной мониторинга бремени лейкемии и оценки терапевтического ответа, используя в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции. Эта стратегия была эффективной для оценки ИТК в пробирке и в естественных условиях и может быть применен для идентификации молекулярно-целевых агентов с терапевтическим потенциалом или для прямого сравнения и определения приоритетности нескольких соединений.

Введение

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частым злокачественным новообразованием у детей ^1,2. Общая выживаемость для педиатрического B-клонов все (В-ОЛЛ) составляет около 85%, но конкретные биологические подтипы, в том числе Т-линии ВСЕ (Т-ОЛЛ), есть еще более плохой прогноз даже при нынешних терапевтических протоколов. Дальнейшее лечение рецидивов ОЛЛ остается проблемой ^3. Хотя большинство взрослых пациентов с острым лейкозом достижения ремиссии при авансовые химиотерапии, многие пациенты все еще ​​страдают рецидив ^4. Текущие химиотерапевтические схемы в лечении острого лейкоза как известно, вызывают токсичности связанных краткосрочные и долгосрочные побочные эффекты. Таким образом, менее токсичные методы лечения, которые специально направлены на раковые клетки с минимальным влиянием на нормальные ткани крайне необходимы. В последние годы акцент был сделан на развитии романа, молекулярно-целевых агентов с специфичности для раковых клеток, часто с использованием итеративного химиюдля создания нескольких активных соединений, которые затем должны быть сопоставлены и приоритетных ^5. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ИТК для лечения острого лейкоза, который может быть использован для оценки одного соединения или для непосредственного сравнения нескольких соединений с целью облегчения разработки лекарств.

Метод, представленный здесь состоит из четырех шагов. Во-первых биохимический (1) и анти-лейкоз (2) деятельность соединения (ий) оцениваются в клеточной культуре, то ингибирование мишени подтвержден на животных моделях (3), и, наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопической модели ксенотрансплантата лейкоз (4). Для этих исследований, важно выбрать соответствующие клеточные линии, которые являются представителями наиболее распространенных биологических подтипов. Клеточные линии должны быть выбраны, которые оба, обозначения целей интерес и не имеют цель интерес для расследования ли мед биологические эффектыiated путем ингибирования мишени. Это особенно важно для развития низкомолекулярные ингибиторы, которые имеют мимо ворот эффекты, которые могут быть важны для противоопухолевой активностью. Кроме того, необходимо выбрать клеточную линию, которая зависит от цели функциональных эффектов, таких как пролиферации или выживания. Предварительные исследования по валидации, цель (вне рамки данной статьи) с использованием РНК-интерференции или другие специальные средства для подавления цель может быть использован для выявления целевых зависит от клеточных линий. Желательно также, чтобы выбрать клеточные линии, которые могут образовывать мышиных ксенотрансплантатов, например, что результаты клеточной культуры можно более непосредственно переводятся в естественных условиях экспериментов в.

Для оценки биохимической активности, опосредованной ИТК в лейкозных клеток, снижение фосфорилирования рецептора может быть использована в качестве индикатора целевой торможения. Вестерн-блот анализ или ELISA анализы могут быть использованы, в зависимости от доступности и специфичности антител.Если антитела с достаточной специфичностью к мишени имеются, анализы ELISA, являются предпочтительными, поскольку они более количественный и эффективным. В случаях, когда антитела с достаточной специфичностью для ELISA отсутствуют, вестерн-блот анализ может быть необходимым. В этом случае иммунопреципитации из большого количества лизата может быть полезно для обнаружения целей, которые находятся в низком избытке. Такой подход особенно актуален для измерения фосфо-белков, которые могут иметь короткий период полураспада для обеспечения быстрых изменений в передаче сигналов в ответ на стимулы окружающей среды. Некоторые фосфорилированные белки чрезвычайно лабильный, скорее всего, в результате комплексообразования с фосфатаз. Для надежной и последовательной обнаружения этих фосфорилированными белков, он также может быть возможным для лечения клеток с pervanadate, необратимого белок-тирозин фосфатазы ингибитора ^6, для стабилизации фосфо-белок до получения целых клеточных лизатов.

Копределить результаты ли биохимическая активность эффектов противоопухолевых, целевые зависит от биологических процессов можно наблюдать в экспериментах на основе клеток. Для лейкоз клеточных линий, анти-лейкоз деятельность опосредована ИТК можно оценить, используя образование колоний анализов, выполняемых в метилцеллюлозы или мягком агаре ^7. Мягкий агар может быть предпочтительным, поскольку это является твердой среды, что является более склонны к манипуляции, если повторное лечение с ИТК необходимо. Хотя многие острые myloid лейкоз (AML) клеточные линии будут образовывать колонии в мягком агаре, большинство все клеточные линии будут только образовывать колонии в метилцеллюлоза, который представляет собой полутвердый носитель. Хотя возможно, чтобы обновить среду и / или в ИТК метилцеллюлозы культур, только небольшие объемы могут быть использованы и с ограниченной частотой. Кроме того, он является более трудным для окрашивания колоний, не нарушая их в метилцеллюлозы. Предварительные исследования должны определить способность соответствующих клеточных линий образовывать колонии в метилцеллюлозы и / или мягком агаре и тон оптимальная плотность клеток в культуре, так что колонии не перекрываются и в достаточном количестве для получения статистически соответствующие данные (обычно 50-200 колоний на 35 мм пластины).

В то время как анализы в пробирке являются надежными и экономически эффективными и имеют меньше этические последствия, чем целых экспериментах на животных, продвижения терапевтических соединений требуется доказательство эффективности и безопасности на животных моделях. Для естественных условиях исследования в, острый лейкоз человеческие клеточные линии могут быть ортотопически пересадить в NOD.Cg-Prkdc ^SCID я l2rg ^tm1Wjl / SZJ (ГЯП) мышей и ИТК могут быть легко введены путем инъекции или желудочный зонд. Некоторые клеточные линии могут потребовать экспозиции мышей NSG к низкой линии в зависимости от дозы радиации клеток для того, чтобы установить ксенотрансплантатов, и в этом случае мышей не могут переносить желудочный зонд без восстановительного периода 5-10 дней после облучения. Эта рукопись описывает поколение B-ОЛЛ и T-ВСЕХ ксенотрансплантаты помощьюконкретные клеточные линии (697) и Jurkat в качестве примеров, но ксенотрансплантатов могут быть установлены в NSG мышей с использованием широкий спектр клеточных линий. В том случае, другие клеточные линии более применимо, требование для облучения, оптимальное количество клеток к трансплантации, и времени начала заболевания и прогрессирования должны быть определены экспериментально. В идеале, эти модели будут иметь полную пенетрантность (каждое животное пересадить заболевает лейкемией), последовательные кинетики (лейкемия прогрессирует же у всех животных), и разумную окно лечения (в идеале 20-30 дней между началом лечения и снятия с изучения в связи с болезнью) . Число клеток, трансплантированных может быть увеличено, чтобы улучшить пенетрантность и кинетическую консистенцию или уменьшена для улучшения обработка окна, если это необходимо.

Чтобы определить, TKIs посредником целевой ингибирование в естественных условиях, образцы собирают из мышей с лейкемией ксенотрансплантатов после обработки ИТК или только транспортного средства. В идеале, дозад расписание администрации для этих экспериментов руководствуются фармакокинетических исследованиях, которые часто могут быть выполнены коммерческими лабораториями и выходят за рамки этой статьи. Если фармакокинетические данные доступны, концентрация соединения, необходимую для эффективного целевого торможения в культуре клеток и максимальной концентрации в сыворотке после однократной дозы ИТК может быть использован, чтобы определить начальную дозу для исследований на животных. Фармакокинетические исследования могут также информировать времени сбора проб после лечения для фармакодинамических исследований и пути введения. Торможение цели можно оценить в любом пораженного органа, но ткани, которые наиболее легко собираются и обрабатываются, являются предпочтительными. Самые острые лейкозы клеточные линии установить в печени, костном мозге, селезенке, периферической крови и центральной нервной системы, хотя конкретные поражаемые органы и степень приживления в этих органах колеблется между моделями. Протокол, представленные здесь оценивает Phosphингибирование о-белок в костном мозге с помощью Вестерн-блот анализ, но твердые органы могут быть легче последовательно собирают и требуют минимального или без обработки перед замораживанием, что позволяет меньше возможностей для деградации фосфо-белков во время сбора и обработки образца. Иммуногистохимическое также может быть использован для оценки солидных опухолей или органы, пострадавших от лейкемии.

Наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопических моделей лейкемии ксенотрансплантатных. Для этих исследований, сроки начала лечения может варьироваться, так что заболевание более или менее установлено. Лечение может начаться немедленно после трансплантации для первоначальных исследований, а затем быть отложено в последующих исследованиях, пока бремя значимом заболевании не обнаружено более тесно приблизить диагностическую модель лечения. В идеале, эти животные модели также имеют потенциал для неинвазивного измерения бремени болезней. Мы оптимизировали методы введения светлячка ЛюцифераГен азы в клеточных линиях лейкемии использованием вирусоподобные частицы, что позволяет для неинвазивного, продольной анализа начала заболевания и прогрессирования и оценки бремени болезней в костном мозге и твердых органов. Важнейшее значение для такого подхода является использование моноклональных люциферазы с метками клеточных линий, чтобы предотвратить изменчивости в развитии люциферазой выражая лейкемии, связанной с использованием поликлональных клеточных линий и не имеет отношения к лечению с ИТК ^8.

Взятые вместе, эти шаги могут быть использованы для оценки одного ИТК или для прямого сравнения и ранжирования нескольких ИТК. В то время как протоколы, представленные здесь, сосредоточены на разработке ИТК, эти методы могут быть адаптированы к другим объектам и соображения, касающиеся развития анализа описаны. Таким образом, эта стратегия может быть более широкое применение в доклинических оценки молекулярно-целевых средств для лечения острого лейкоза.

протокол

Все эксперименты с участием животных следовали нормативных стандартов, утвержденных в Университете Колорадо комитета уходу и использованию животных институциональной. Продемонстрировали Протокол был одобрен Университета Колорадо комитета уходу и использованию животных институциональной.

1. Phospho-белок Вестерн-блот

1. Подготовка лизатов
   1. Культура клеточные линии, экспрессирующие рецептор тирозинкиназы, представляющих интерес. Урожай клеток и пластины 3-5 х 10 ⁶ клеток / образец в 400 мкл среды для выращивания в культуре ткани блюдо 48-а. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 2-3 часов.
   2. Добавить 100 мкл раствора 5x ИТК в ростовой среде и инкубировать в течение 60 мин.
   3. Подготовка лизирующего буфера 50 мМ HEPES (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10% (об / об) глицерина, 1% (объем / объем) Тритон Х-100, и ингибиторы протеазы. Если культуры не будут относиться с pervanadate до сбора урожая, добавить ингибиторы фосфатазы (orthova 1 мМ натрияnadate и 0,1 мМ молибдата натрия) в буфере для лизиса.
   4. Подготовка pervanadate (PV) ингибитор фосфатазы решение непосредственно перед использованием. Приготовьте 0,3%-ный раствор перекиси водорода (Предостережение) в холодном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в темном трубки на льду (1:100 разбавление 30% раствора а). Отварить аликвоты 0,2 М ортованадат натрия (О.В., ВНИМАНИЕ) исходного раствора в течение 5 мин. Развести 1:10 в PBS, чтобы сделать 20 мМ раствора О.В. при комнатной температуре (RT). Смешайте 0,3% пероксида водорода и 20 мМ OV 1:01 и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
   5. Развести PV в полной среде (60 мкл П.В. + 940 мкл среды). Добавить 100 мкл разбавленных PV / лунку. Инкубировать при 37 ° С в 5% СО ₂ в течение 3 мин, а затем поместить пластину на льду.
   6. Сбора клеток в холодной микроцентрифужные пробирки при 2500 оборотах в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 120 мкл буфера для лизиса. Инкубируют на льду в течение 15 мин. Уточнение лизата в холодном микроцентрифуге при 6000 оборотах в минуту в течение 3 минут. Трансфер Супеrnatant к свежей холодной трубки. Хранить при температуре -80 ° С.
2. Иммунопреципитация
   1. Спином вниз Белок г сефарозы в микроцентрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант и мыть шарики 2x 1 мл холодной PBS. Добавить равный объем PBS, чтобы сделать 50% суспензии. Добавить первичного антитела и 20 мкл 50% белка G шарики к каждому образцу. Выдержите в течение 2 часов - O / N при 4 ° С на ротатора.
   2. Пульс вниз бисером в холодном микроцентрифуге при 9000 оборотах в минуту. Удалить супернатант и мыть шарики 2x 150 мкл холодного буфера для лизиса. Спин в холодной микроцентрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мкл образца 2X SDS буфера с 2-меркаптоэтанолом (ВНИМАНИЕ). Используйте немедленно или хранить при температуре -80 ° С.
   3. Образцы кипятят в течение 5 мин и работать на SDS-PAGE трис-глицин геля. Передача белков на нитроцеллюлозную мембрану и обнаружить фосфо-белок помощью вестерн-блоттинга.
   4. Промыть блот водой, а затем инкубируют в 2% SDS, 62,5 мМ Трис (рН 6,8), 0.1 М β-меркаптоэтанола (ВНИМАНИЕ) в течение 30 мин при 50 ° С Промыть 2x водой, а затем моют в течение 60-90 мин в 5-6 изменений TBS-T, чтобы удалить зачистки раствора.
   5. Обнаружение всего-белок помощью вестерн-блоттинга.

2. Метилцеллюлоза Анализ

1. Алиготе 4 мл метилцеллюлозы человеком базовой среды в 50 мл конические пробирки с использованием стерильного большого диаметра тупым концом иглы. (Примечание:. Метилцеллюлозы может быть аликвоты и хранили при -20 ° С. оттепели при комнатной температуре O / N перед использованием)
2. Добавить 500 мкл 10х ИТК или транспортного средства в среде роста в 4 мл метилцеллюлозы и вихревой смеси в течение 10 сек.
3. Урожай и кол клетки. Приготовьте суспензию клеток в ростовой среде в концентрации, которая является 10x выше, чем концентрация конечного элемента. Добавить подвеска 500 мкл клеток в метилцеллюлозы смеси. Vortex в течение 10 сек и оставьте на 10 мин для удаления пузырьков.
4. Составьте 4 мл метилцеллюлозы смеси с помощью шприца 5 мл и стерильной крупэ родила тупым концом иглы. Избегайте составления пузыри. Разлить 1 мл смеси метилцеллюлозы в центре трех 35-мм тканевых культуральных планшетах. Вихревой посуду, пока нижний не будет полностью покрыта метилцеллюлозы.
5. Для каждого метилцеллюлозы пластины, подготовить 10 см стерильного планшета для культуры ткани с двумя дополнительными 35 мм тканевых культур пластин, заполненных стерильной воды для обеспечения влажной среде. Место культуры в воде рубашкой инкубатор при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 10-14 дней.
6. Всего колонии через 1-2 недели. Колонии должны быть более чем 20 клеток и не перекрываются. Колонии можно пересчитать использованием инвертированного микроскопа, снабженного столике микроскопа с сеткой или с использованием автоматического счетчика колоний. Изменение размера колоний или морфологии в ответ на обращение с ИТК также должна быть оценена. Для улучшения обнаружения счетчик колоний, пятно колоний путем добавления 60-100 мкл (3 - (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид зольution (МТТ, 5 мг / мл в H ₂ O, магазин при -20 ° С, защищать от света, ВНИМАНИЕ) по каплям по поверхности каждой пластины и инкубации в течение 8 часов при температуре 37 ° С в 5% СО _2.

3. Мягкий Агар Анализ

1. Подготовьте 1% благородную агар для нижнего слоя, 0,7% благородного агар для верхнего слоя и 2x роста среды. Равновесие 2x питательную среду в водяной бане при 42 °. Нагрейте 1% и 0,7% благородный агар в микроволновой печи (примерно 1 min/100 мл) и уравновешивают в водяной бане при 42 ° C. Смешать равные части 1% агара и 2x среды и отдельно 0,7% агара и 2x среды в 50 мл conicals. План 10 мл мягком агаре смеси / шесть-луночный планшет для каждого слоя.
2. Этикетка 6-а чашки для тканевых культур. Заполните каждую лунку с 1,5 мл 1% мягкой агар смеси. Избегайте пузырей во время посева. Сухие пластины с крышками выходные в стерильных капот в течение 30 мин.
3. Граф клеток. Приготовьте суспензию клеток в ростовой среде в концентрации, которая выше, чем 500x конечном Концентрац клетокна. Добавить клеточной суспензии в 0,7% агара смеси, хорошо перемешать и распределить 1,5 мл агара смеси клеток на верхней части 1% слое агара. Пусть верхний слой затвердевать в течение 30 мин.
4. Приготовьте 1х питательную среду, содержащую Tki или управления транспортным средством. Добавить 2 мл среды с требуемой концентрации ИТК в верхней части топ слой агара.
5. Выдержите культур в течение 10 дней при 37 ° С в 5% CO _2. Снимите и замените, покрывающий среды каждые 3 дня.
6. Когда видны невооруженным глазом, аспирации наложение среднего колонии и добавить 200 мкл нитро-тетразолия синий раствор (1 мг / мл NBT в H ₂ O, магазин при 4 ° С, защищать от света, ВНИМАНИЕ). Вернуться на инкубаторе в течение 24-48 часов. Переход к 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч до подсчета. Окрашенные плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца. Всего колонии с помощью микроскопа или автоматизированный счетчик колоний.

4. Оценка Phospho-белка торможения в естественных условиях

1. Сбор грлоктей растет в логарифмической фазе путем центрифугирования в настольную центрифугу на 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин. Промывают клетки один раз стерильной PBS и ресуспендируют в PBS при соответствующей концентрации (обычно 1-5 х 10 ⁷ клеток / мл). Трансплантации клеток в объеме 100 мкл в 6-12 недельных мышей NSG путем внутривенной инъекции в хвостовую вену с использованием инсулиновый шприц 28 г. Поместите животное в фиксатор, нагрейте хвост в стакане теплой воды, чтобы расширить вены и очистите хвост с хлоргексидином тампоном перед инъекцией. После инъекции надавливайте на месте инъекции, не используя стерильную марлю, пока остановки кровотечения. Пересадка не менее 3 животных / группа. Поддержание мышей на воде, содержащей 1 мг / мл гентамицина сульфат.
2. Четырнадцать дней после трансплантации, лечения животных с ИТК или транспортного средства только и образцов урожая для анализа целевой торможения. Взвешивание животных и лечить с соответствующей дозы (мг / кг массы тела) из ИТК или транспортного средства. Администрирование лечение в объеме 5 мл / Kг веса тела путем внутрибрюшинного (IP) инъекции или 10 мл / кг массы тела перорально через зонд. Для инъекцией, сдерживать мышь вручную и ввести в правом нижнем квадранте живота, используя 29 г иглы. Для желудочный зонд, сдерживать мышь вручную и удерживайте животное в вертикальном положении. Поместите через зонд трубку в рот по языку и в задней части рта. Применить небольшое давление, чтобы пройти трубку через пищевод в желудок. Нажмите на поршень шприца для введения лечение. Если поршень не угнетает легко через желудочный зонд иглы должны быть удалены и перемещены. Подготовка Tki формулировки непосредственно перед использованием.
3. Если pervanadate лечение желательно, готовят раствор PV 20 мин до сбора урожая, как описано выше (этап 1.1.4) и разбавленной в среде с 1 мкМ MgCl ² и 100 ед / мл ДНКазы (120 мкл PV + 880 мкл среды). Примечание: PV стабилен в течение по крайней мере 1 ч после разбавления.
4. Жертвоприношение животных по CO ₂ наркоза в арраз (а) propriate после лечения. Проанализируйте бедра, удалив мех, кожу и мышцы от всей ноге, так что кости совершенно беззащитны. Удалите бедра, закрепляя с рассекает ножницы чуть ниже тазобедренного сустава и снова выше коленного сустава. Переезд в чашке Петри и флеш костного мозга с 1 мл холодного PBS или разбавленного раствора PV с помощью шприца и 27 г иглы. Если обработкой PV, инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин.
5. Подготовка лизатов и анализировать фосфо-белка и всего-белковые уровни, как указано выше (шаги 1.1.6-1.2.5).
6. Количественного относительную фосфо-белка и уровней общего числа содержанием белка для каждого образца с помощью денситометрии. Рассчитать phospho-protein/total-protein по отношению к среднему значению phospho-protein/total-protein для обработанных носителем животных.

5. Оценка по борьбе с лейкемией деятельности ИТК во всех Xenograft моделей

1. При необходимости подвергать мышей до 200 сГр излучения в RS-2000 облучателя в один прекрасный день Приог к трансплантации. Пересадка мышей с лейкемией клеточных линий, как описано выше (шаг 4.1). Пересадка по крайней мере 6 мышей на группу. Определить мышей на слух удар. Кроме того, черный маркер может быть использован для идентификации мышей с метками на хвосты. Добавить обогащение в клетках, чтобы уменьшить вероятность клетка ответной агрессии в ходе исследования.
2. Treat мышей с ИТК или транспортного средства только как описано выше (этап 4.2). Мониторинг состояния здоровья мышей ежедневно через осмотра и определения массы. Ожидаемые симптомы лейкемии (снижение уровня активности, потеря веса, паралич задних конечностей и глазных инфекций). Потеря веса более 10% -15%, как правило, ассоциируется со смертью мыши в течение двух дней и, как правило, суррогатная конечная точка смерти в соответствии со стандартными требованиями IACUC.
3. Монитор приживление и развитие лейкемии через в естественных условиях системы формирования изображений биолюминесценции до 2 раз в неделю. Подготовьте D-люциферин маточного раствора 200x (30 мг / мл) в Steriле воды. Осторожно перемешать с помощью инверсии до D-люциферин полностью не растворится. Используйте немедленно или аликвоты и заморозить при -20 ° С До визуализации с использованием в естественных изображений биолюминесценции систему, оттаивать аликвоты D-люциферин при комнатной температуре и разбавленный 1:02 в PBS до конечной концентрации 15 мг / мл и фильтр стерилизуют через фильтр 0,2 мкм.
4. Обезболить мышей до визуализации с 1,5% вдыхаемого изофлураном в кислороде. Монитор достаточную анестезию, характеризующийся мышечной релаксации, потеря движения и потеря ответ на схождение пинч стимуляции.
5. Непосредственно перед визуализации, управлять 150 мг / кг массы тела D-люциферин И. П. инъекции (10 мкл 15 мг / мл люциферин / г массы тела).
6. Используйте в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции захватить 2 серии изображений с последовательных 30, 60 и 90 сек воздействия и получения окончательного изображения с сек воздействия 120. После обработки изображений, вернуться мышей в клетки и монитор для выхода из наркоза. В зависимости отИнтенсивность биолюминесценции, время экспозиции может изменяться. Оптимальные время экспозиции должны быть заранее определены для данной модели и все соответствует, так что интенсивность сигналов для отдельных временных точках сопоставимы по всей исследования.
7. Определите интенсивность биолюминесценции для каждой мыши с помощью живой образ 3.2 сбор и анализ программного обеспечения. Определите значения общего потока, измеренные в фотонов / второй рисуя регионах, представляющих интерес (ROI) одинакового размера над каждой мыши.
8. Жертвовать мышей CO ₂ экспозиции и цервикальной дислокации если умирающие, демонстрируя паралич, в случае более чем 15% потерю веса, или в конце исследования. Проанализируйте мышей и записывать наблюдения (например, расширение селезенки, печени или лимфатических узлов; бледно костный мозг). Проанализируйте бедра и флеш костный мозг с холодной PBS с использованием 27 г иглы.
9. Сбор клеток в микроцентрифуге при 2500 оборотах в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в PBS, содержащем 2% FBS и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.Сбор клеток и пятно с 20 мг / мл DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид, 1:1000) и FITC-конъюгированного α-hCD45 (1:100) или мышь IgG управления ₁ изотипа антитела (1:100) . Оцените приживление лейкоз с помощью проточной цитометрии. Ворота на жизнеспособной популяции (DAPI отрицательный) и определить процент CD45 + клеток (бластов% костного мозга).

Результаты

Анализы, представленные здесь оценивать биохимические и функциональные эффекты опосредованы ИТК и может быть использована для оценки новых соединений на основе степени целевой торможения в пробирке и в естественных условиях, уменьшение образования колоний, и задержка в во?...

Обсуждение

Эта рукопись описывает эффективную стратегию оценки новых ингибиторов тирозинкиназы при лечении острого лейкоза. Используя этот подход, биохимические и анти-лейкемии деятельности оцениваются сначала в клеточных анализов в пробирке, а затем в моделях ксенотрансплантатов в ес?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00