МикроРНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация на формалин ткани почки

Резюме

В этой статье описывается в протокол гибридизация оптимизированный для колориметрического обнаружения микроРНК выражения в формалине секциях фиксированных в почках.

Аннотация

В этой статье мы опишем метод колориметрического обнаружения микроРНК в почках через в гибридизация с дигоксигенином отмеченных микроРНК зондов. Этот протокол, первоначально разработанная Клостермана и коллег для обширного использования с Exiqon микроРНК зондов ^1, был изменен, чтобы преодолеть проблемы, присущие анализа микроРНК в тканях почек. К ним относятся такие вопросы, как определение структуры и трудно удалить остаточный зонд и антитела. Использование относительно тонкий, толщиной 5 мм, срезы ткани позволили четкой визуализации структур почек, в то время как сильный сигнал зонда был сохранен в клетках. Кроме того, концентрация зонда и условия инкубации были оптимизированы для облегчения визуализации микроРНК выражения с низким фоном и неспецифической сигнала. Здесь, оптимизированный протокол описан, охватывающий первоначальный сбор тканей и подготовку через монтажа слайдов в конце процедуры. Основная ComponeNTS этого протокола могут быть изменены для применения в других тканях и моделей клеточных культур.

Введение

МикроРНК небольшие (длиной около 22 нуклеотидов) некодирующих РНК, которые эндогенно производится. Как правило, они функционируют для подавления экспрессии белка через репрессии трансляции или деградации мРНК. микроРНК связываются с мРНК мишеней с неполной комплементарности, что делает возможным для одного микроРНК для подавления несколько целей.

Понимание того, какие типы и структуры клеток выразить микроРНК является важной частью понимания механизмов, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клеток, тканей фенотипов. Хотя методы, такие как микроРНК последовательности, количественной ПЦР, Нозерн блоттинг может быть использован для обнаружения микроРНК в целом тканей, этот подход не позволяет определить, какой конкретный тип клеток они пришли в данной ткани. Рассечение клеточных и структурных компонентов до анализа с использованием этих методов может быть очень трудно и условия, необходимые для достижения адекватных обособления может привести к альterations в экспрессии или деградации РНК гена. микроРНК в гибридизация является метод, используемый для визуализации местоположения микроРНК и уровни экспрессии в тканях. Этот метод особенно ценен в тканях, состоящих из разнородных структур, таких как почки.

Микро РНК, как было показано играют регуляторную роль в ^2,3 развития почек и физиологии ^4. экспрессии микроРНК изменения, также было показано, участвуют с почечной патологией, таких как фиброз ^5-10, диабетической нефропатии ^7, почечной карциномы ^11,12 и острой почечной ^13. В нашем исследовании, мы обнаружили, что оптимизации микроРНК в гибридизация для тканей почек было ценным для определения точных структурных местоположения выражения микроРНК как в здоровье и болезни ^14. Определение трубчатого и клеточной экспрессии различных микроРНК является важным, поскольку их регулирование таrgets может зависеть от клеточных функций. В пораженных государств важно также определить, как изменения в экспрессии микроРНК могут быть функции влияет.

Цель метода, описанного здесь в том, чтобы построить на существующих методологий ISH разработанных Клоостерман др.. ^15, другие исследователи ^16,17, а те, предложенный Exiqon ¹ и оптимизировать метод формалином тканях фиксированных в почках. Мы успешно использовали этот метод для идентификации различных региональных различий в почечной выражения микроРНК микроРНК-382 с односторонним обструкции мочеточника ^18. Этот подход может быть использован с другими тканями, а также с дополнительной оптимизации.

протокол

1. Почечной ткани Разделы

1. Зафиксированные в формалине (10%) разделы почек парафин нарезают на предметных стеклах при толщине 5 мм с использованием Microm HM 355 S. Слайды можно хранить в течение нескольких месяцев анализа.

2. Подготовка решения

1. Подготовить 1 л 1x PBS в DDH ₂ O в автоклавируемый верхней бутылки винта. Заполните другую бутылку 1 л DDH ₂ O. Добавьте 1 мл DEPC каждому бутылки, крышки и энергично встряхивают. Пусть решения на ночь при комнатной температуре, чтобы разрушить РНКазы и затем автоклав. Добавить 400 мл Tween-20 в 1 л 1х PBS, чтобы сделать PBS-T.
2. Подготовка протеиназы K буфера (50 mMTris-HCl, рН 8,0 и 1 мМ CaCl ₂ в DEPC-обработанной воде).
3. Готовят раствор 0,2% глицина в PBS-T.

3. Тканевый препарат

1. Подготовка большой объем гибридизации буфера (50-100 мл), состоящий из 50% формамида, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина и 500 мкг / мл дрожжевой РНК в DEPC лечение DDH ₂ O. Разделить на 1 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С.
2. Удалить парафин из ткани путем промывки 3 раза в свежем ксилоле в течение 5 мин каждый.
3. Увлажняет срезах тканей на 5 мин инкубации в уменьшении концентрации этанола (100%, 75%, 50% и 25%) в DDH ₂ O.
4. Лечить слайды с достаточно DEPC, чтобы полностью покрыть срезы ткани (примерно 0,4-0,5 мл) в течение 1 мин. Убедитесь ткани не высыхают.
5. Промойте скользит в DEPC лечить PBS-T дважды в течение 5 мин, собирая DEPC содержащих отходов для надлежащей утилизации. Все реагенты должны быть DEPC лечение для устранения РНКаз с этого момента.
6. Prewarm протеиназы К буфер и добавить протеиназы К до конечной концентрации 10 мкг / мл. Крышка срезах ткани протеиназой К раствору и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
7. Быстро удалить proteinasрешение для электронной К и добавить 0,2% глицин в PBS-T в течение 30 сек.
8. Промыть скользит в DEPC обрабатывали PBS-T дважды в течение 30 секунд каждый.
9. Fix разделы в свежеприготовленный 4% параформальдегида в течение 10 мин.

4. Гибридизация

1. Добавить 50 мкл буфера для гибридизации (50% формамид, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина, 500 мкг / мл дрожжевой РНК) на срез ткани и покрытие с РНКазы HybriSlips сократить просто больше, чем срезах тканей.
2. Prehybridize секции в контролируемой влажностью гибридизации печи в течение 2 ч при температуре гибридизации, определенной для «дигоксигенин меченым зондом 3 (обычно ДНК Tm зонда -21 ° С, (т.е. 54 ° C в течение микроРНК-382, ДНК-зонд Tm = 75 ° C ), с помощью ткани лабораторных салфетки, пропитанные 50% formamide/50% 5x SSC, чтобы держать камеру увлажняется.
3. Развести зонд микроРНК, положительный контроль (U6, небольшой ядерный РНК) и отрицательный контроль (яичницупоследовательность) до 40 нМ в гибридизации буфер (75 мкл буфера необходимо в каждой секции).
4. Нагреть зонда гибридизации в буфере при 65 ° С в течение 5 мин.
5. Удалить слайды из гибридизации духовке и удалить покровные и избыточный буфер гибридизации с Предгибридизацию.
6. Добавить 75 мкл зонда, содержащего буфера на срез ткани, непосредственно в ткани. Обложка ткани с HybriSlips просто достаточно большой, чтобы покрыть срезы ткани.
7. Ведение слайд уровень держатель, вернуться к гибридизации духовке в течение инкубации в течение ночи при температуре от шага 4.2 (примерно 16 ч).

5. Строгость Вымойте

1. Добавить 200 мкл 2x SSC, с подогревом до температуры гибридизации, как раз под одного края покровные, чтобы помочь освободить покровное из ткани. Удалить покровное, наклоняя слайд.
2. Промыть слайды в 200 мкл 50% формамида, 50% 2х SSC при 3x температуры гибридизации в течение 30 мин каждый.
3. Прополоскатьслайды 5x в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере на низкой скорости.

6. Обнаружение

1. Инкубировать слайд в блокирующем буфере (2% козьей сыворотки лошади или, 2 мг / мл BSA в PBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном шейкере на низкой скорости.
2. Развести анти-DIG-AP Fab фрагменты в блокирующем буфере 1:100. Добавить 100 мкл на срез ткани и накрыть HybriSlips сократить достаточно большой, чтобы покрыть срезы.
3. Инкубируйте антитело в увлажненной камере при 4 ° С в течение ночи (около 16 ч).
4. Вымойте слайдов в PBS-T 7x, в течение 5 мин каждый на круговой качалке при низкой скорости.
5. Промыть слайдов в AP буфера (100 мМ TrisHCl рН 9,5, 50 мМ MgCl _2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, в течение 5 мин каждый.
6. Добавить решение НБТ / BCIP А.П. буфера (200 мкл/10 буфер мл)
7. Добавить 400-500 мл разведенного раствора НБТ / BCIP к каждому слайду, чтобы полностью покрыть все срезах тканей. Разработать в темном, уровня, увлажнительIED камера для 4-5 часов.

7. Монтажные Слайды

1. Высушить секции в возрастающих концентраций этаноле (25%, 50%, 75%, 100%) в течение 5 мин каждый.
2. Выдержите в ксилола 5x, чтобы очистить разделы.
3. Гора скользит в предметный столик Permount монтажа средних и сухой в течение ночи.

Результаты

Области раздела тканей, которые становятся высохли в течение гибридизации, инкубации или мыть шаги обычно в конечном итоге окрашивания темнее при разработке НБТ / BCIP. Рисунок 1 показывает часть секции почек, в которых HybriSlip соскользнул из краю ткань, что позволяет ему стать час?...

Обсуждение

Целью этой статьи было описать протокол для микроРНК в гибридизация, который хорошо работает в формалине тканей фиксированных в почках. При разработке этого протокола несколько важных источников окрашивания артефакта были определены. Пристальное внимание к этим вопросам может ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PBS	Gibco	70011044
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758
Tween-20	Sigma	P1379
Xylenes	Sigma	534056
Ethanol	Ultra Pure	200CSPTP
Tris-HCl	Life Technologies	15506-017
CaCl2	Sigma	C2536
Glycine	J.T. Baker	4059-00
Citric Acid	Sigma	C2404
Formamide	Sigma	F9037
20x SSC Buffer	Life Technologies	15557-044
Heparin	SAGENT	25021-400-30
Yeast RNA	Life Technologies	AM7118
MgCl2	Sigma	M8266-1004
NaCl	J.T. Baker	4058-01
Proteinase K	Fermentas	EO0491
3’ DIG- miRNA probe	Exiqon	miR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probe	Exiqon	99004-05
3’ DIG- U6 miR probe	Exiqon	99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab Fab	Roche	11093274910
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Permount	Fisher	SP15-500
Coverslips	Fisher	Fit to tissue size
Microtom HM 355 S	Thermo Scientific	23-900-672
In-slide Out Hybridization Oven	Boekel	241000
Aluminum Tray Assembly	Boekel	C2403973
Stainless Steel Rack Insert	Boekel	C2403754