Техника для изучения членистоногих и микробных сообществ в Tree тканей

Резюме

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Аннотация

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

Введение

Флоэме и тканей коры хвойных кочуют тысяч организмов. Phloeophagy, кормление на флоэмы тканях внутренней коры, это привычка, как правило, связаны с короедом, woodborers и ряд других беспозвоночных и микроорганизмов таксонов, которые живут в деревьях ²³ Короеды. (Coleoptera: Curculionidae) развиваться и жить в флоэмы за исключением короткие периоды, когда взрослые стремятся новых хозяев деревья. ³¹ Короеды были широко изучены в связи с их экономическим последствиям на деревьях ^18,19, но прямые поведенческие наблюдения за насекомыми внутри дерева материалов были ограничены. ⁴ Кроме того, галереи построено короедом стать местом обитания для множества видов. ¹¹ Огромное количество грибов ^30, бактерии ^3, клещи ^10,21 и нематоды ^16,19 наряду с другими хищных и паразитических членистоногих ^22,24 населяют флоэмы материал. Методы, приведенные здесьдля обеспечения непосредственного наблюдения короедов и клещей, а древоточцев, что, как правило, живут в подкорковых средах. Незначительные изменения в протоколе могут быть сделаны для изучения грибков и бактерий.

Короеды и связанные с ними организмы внутри деревьев тканей были изучены с помощью "флоэмы бутерброд." Раннее использование этой техники можно найти в литературе, восходящей к 1933 году, когда он был использован для наблюдения за личиночных возрастов из ели Дугласа жука (Dendroctonus pseudotsugae). ² флоэмы сэндвич пережил много выводов, как различные материалы стали доступны. Изначально это устройство состояло из куска флоэмы помещен между двумя пластинами стекла, прижимаются друг к другу с помощью резинки. ² Позже, зажимы, ленты, клей, пластик и другие материалы, которые были использованы в строительстве сэндвич. ^{13,14 , 15,17,26,28} Протокол, описанный здесь предлагает улучшения по сравнению с некоторыми из последних конструкций. Например, вмимо, тестовые видов были введены в сторону бутерброд, между пластинами стекла или пластика. Это ограничивало строительство галерей в одном направлении. Использование входных отверстий в верхней плите позволяет большую свободу для испытаний видов инициировать естественную конструкцию галереи. Еще одно преимущество представленного протокола является его упрощенной конструкции, которые могут быть легко сконструированы с несколькими инструментами. Использование флоэмы сэндвич позволил непосредственных наблюдений пищевого поведения, размножения, развития и взаимодействия организмов, которые в противном случае не было бы возможным. ^{1,5, 22} Этот метод также является отличным инструментом для K-12 образования и науки программы и дисплеи.

Есть несколько тонкостей в создании флоэмы бутерброд, которые трудно интерпретировать из или не сообщили в рукописях. Мы считаем, что визуальная (т.е. видео) описание производстве флоэмы сэндвич необходима и будетценность для ученых и педагогов, заинтересованных в изучении phloeophagous организмов. Наш протокол обеспечивает простой и недорогой способ наблюдать членистоногих, микробы и другие организмы, обитающие флоэмы ткани.

протокол

1. Флоэма Выбор и удаление из дерева

1. Выберите дерево с определенными характеристиками. Сбор флоэму из сосны (т.е. деревья в роду Pinus), поскольку они имеют отличительную флоэмы слой толщиной в несколько миллиметров. ^18,27 Как только дерево находится, у которого есть несколько нижних ветвей, осмотрите его на каких-либо других дефектов, таких как нападения насекомых и / или патогенных микроорганизмов. Кроме того, использование флоэму от других хвойных деревьев, таких как ели в флоэмы бутербродов. ⁹ Другие виды деревьев могут быть пригодны для флоэмы удаления таких как лиственных пород.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хвойные деревья с большими кронами, как правило, имеют толстую флоэмы ткани. Чтобы максимизировать количество флоэмы, то лучше, чтобы рубить деревья, которые имеют несколько недостатков и филиалы на багажнике (боле). Сосновые виды, которые самостоятельно обрезка работа лучше. Флоэма обычно толстый в период вегетации и толще выше туловища, чем у поверхности земли. Флоэма иногда трудно убре с деревьев во время падения или зимнего сезонов.
2. Вырежьте дерево вниз или использовать недавно срезанных журналы получить флоэмы ткани. Выберите падающий направление, что позволит свести к минимуму повреждения дерева, а также близлежащие деревья. Cut ответвляется ствола, что облегчает доступ к коре материалов в процессе флоэмы удаления.
3. После того, как дерево режется (вырублены; упал на землю) начинают выскабливание кору ствола с резким дро лезвием (рис 1А.). Очистите область коры от пока не будет достигнуто флоэмы слой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: флоэмы слой, как правило, светлее (например, кремового цвета) и влажный, в то время как внешняя кора суше и темнее по цвету (рис 1В.). Соблюдайте особую осторожность, чтобы не поцарапать флоэму. Площадь коры соскабливают зависит от размера куска флоэмы (ов), необходимого.
4. После кора снимается, вырезать контур флоэмы кусок острым ножом. Убедитесь, что нож режет все пути к ксилеме (рис. 2А).
5. Чтобы снять флоэму, начинаются в углу флоэмы кусок с помощью пальцев, чтобы аккуратно отогните флоэму. Используйте нож, чтобы помочь в выскабливание флоэму от ксилемы. Продолжить потянув флоэму от пока весь кусок не будет удален.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флоэма обычно отслаивается от дерева простой летом. Для флоэмы, который чрезвычайно трудно удалить, шпатель образный инструмент может помочь в этих усилиях.
6. Сразу Поместите флоэмы кусок в стерильный пакет. Для достижения наилучших результатов, вакуумная печать мешок (рис. 2В) или, при использовании Ziploc сумки, весь воздух из мешка. Это увеличивает долговечность флоэме. По желанию, разместить несколько кусков флоэмы в одном мешке. Магазин флоэмы в герметичных мешках немного выше нуля (от 1 до 10 ° С), чтобы сохранить его свежесть.

2. Создание Sandwich флоэмы

1. Вырежьте два равных куска прозрачного акрила, поликарбоната или аналогичного жесткого, четкого материала (например, стекла) слегка большаяR, чем кусок флоэмы (рис. 2в). Круглый краев акрила, чтобы предотвратить углы от разрыва уплотнение парафином. Этот протокол использует 1/8 в. Толстого прозрачного акрила.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер части сокращения зависит от потребностей субъекта организма и продолжительности исследования. Например, пара короедов использует 4 дм ² из флоэмы над месяцев, но нужно будет только 1 дм ^2, если исследование проводится в течение нескольких дней.
2. Просверлите отверстие в одном из акриловых частей, чтобы обеспечить въезд исследуемого организма (ов). Размер и число отверстий зависит от целей (фиг. 2D).
3. До размещения флоэму между акриловых частей, стерилизовать акриловую поверхность (с> 70% этанола) или, при использовании нового акрил, снимите защитную пленку.
4. Поставьте свежий кусок луба между стерильных акриловых штук. Orient акриловая часть с отверстием (ов) на внутренней или внешней стороне флоэмы, whicheveR необходим. Как правило, сталкиваются внешнюю сторону флоэме (боковой, что было на нем кору) в направлении входных отверстий.

3. Герметизация Бутерброд флоэмы

1. Чтобы создать временное уплотнение вокруг флоэмы сэндвича, используют 2 в. Широкие полоски парафином тянут по краям флоэмы сэндвича (фиг. 2С). С другой стороны, использовать обертку поливинилиденхлорид, чтобы запечатать края. ⁶ Затем поместите фиксатор с каждой стороны сэндвича, чтобы сжать акрил к флоэме. Убедитесь, что вся поверхность зажимается, чтобы предотвратить воздушное пространство между акрилом и флоэмы (рис 2С). Если не на прочность крепления, образцы могут двигаться в между акрилом и флоэмы.
2. Для создания полупостоянная печать добавить без склеивания эпоксидной или вазелин флоэме. Убедитесь, что материал полностью окружает флоэму. Затем, с помощью зажимов или винтов с болтами (возможно, потребуется просверлить отверстия загодя) провести акрил плотно, чтобы флоэме.Бутерброды только оставаться жизнеспособными в течение до одного или двух месяцев.
3. В зависимости от потребностей кислорода в исследуемых организмов, добавить воздушный фильтр на одной или более сторонах сэндвича. Это позволит воздуху поступать в флоэмы бутерброд, но ограничить потери воды из флоэмы. Мы используем простые угольные фильтры, которые также снижают риск грибковых и бактериальных загрязнений.
4. Для исследования образцов, которые требуют въезд и выезд по желанию, заменить один из акриловых куски дерева или подобного материала, что насекомое может несли в. Это особенно важно для наблюдения древоточцев, потому что после того, как их личинок состояние завершается в флоэмы слоем, они потом родила в древесине.
5. Для предотвращения испытуемых от выхода из отверстия входа, разместить небольшие чашки Петри (или других объектов, ленточные) над отверстиями, блокирующий побег. Поскольку организмы, обитающие в этих пространствах, приучают к низким уровнем освещенности, это может быть необходимо, чтобы поместить бутерброды в темной комнате или коробку, или место OPaque материал сверху, чтобы блокировать свет.

4. наблюдений Организмы в Sandwich флоэмы

1. Представьте исследования образцов в входного отверстия флоэмы бутерброд (рис. 2D). Соблюдайте образцов с использованием рассекает микроскоп под красный свет или белого света, установленного на низком уровне (рис. 2Е).
2. Для записи деятельности или роста образцов в флоэмы бутерброд прикрепить камеру или видеокамеру в микроскоп. Прикрепите специальные видеокамеры в окуляр микроскопа (рис. 2Е & F). Для очень маленьких организмов, таких как клещей, нематод и ложноскорпионов, используют видеокамеру высокой четкости, прикрепленный к микроскопу.
3. Чтобы записывать звуки, вставить микрофоны в входного отверстия флоэмы сэндвич или через боковой стороне флоэмы сэндвича. Поскольку входное отверстие невелико, использовать небольшое микрофон, таких как конденсаторный микрофон.
4. Для записи со стороны или поверхностифлоэмы бутерброд использовать пьезоэлектрический элемент (рис. 3б). Для воспроизведения звука, использовать тот же элемент пьезо или прикрепите тактильную преобразователь (excitor) к поверхности верхней или нижней части акрила.

Результаты

Протокол, описанный выше, позволят исследователю наблюдать организмы, которые живут в загадочной среды под корой дерева. Чтобы проиллюстрировать использование этой техники мы описываем репрезентативное исследование с нашей лаборатории, которая использует эту технику. ¹² в этом эксперименте, флоэмы бутерброды были использованы для наблюдения эффектов акустических методов лечения в области репродуктивного выхода, расстояние туннельного и выживания короедов (рис . 2E и 2F). Прямое наблюдение жуков, стало возможным благодаря применению флоэмы бутерброд, показал несколько интересных выводов. Во-первых, мы записали ежедневные расстояния туннелирования, пометив место жуков "на акриловой с маркером каждый 24h. Этот процесс показал существенных различий звуковых обработок, которые были бы без скрытых флоэмы сэндвича. Далее, мы наблюдали снижение яйценоскости с конкретным звуковых обработок. Мобильный характер флоэмы сэндвич разрешено для еGG наблюдения должны быть завершены под микроскопом рассекает, не нарушая жуков. Во время этих наблюдений, мы захватили жук откладки яиц поведение с высоким разрешением камеры, прикрепленной к микроскопом. Другие заметные наблюдения включали убийство товарищей и начало полета, связанного с конкретным акустических методов лечения. Флоэмы сэндвич-анализ имеет решающее значение для нашего исследования короед ответов на акустических методов лечения. Эти открытия, которые бы невозможно наблюдать под корой дерева, являются ценным вкладом в разработку вариантов регулирования борьбы со вспышками короеда.

Рисунок 1.) Необходимые инструменты для удаления коры с дерева. Пункты 1 и 2 являются ничья лезвия, используемые, чтобы очистить кору дерева. Пункты 3 (Hatchet) и 4 (тянуть пила) полезны для удаления ветокрядом площадь бритья. B) Использование вытяжки лезвием, чтобы удалить кору с дерева. Обратите внимание на светлый цвет флоэмы под красноватой корой.

Рисунок 2.) Удаление флоэмы после коры соскабливают из дерева. В) Fresh флоэмы хранится в вакуумной запечатанном пакете. C) Флоэма сэндвич с зажимы проведения акриловые воедино и парафильмом по краям, чтобы предотвратить загрязнение и высыхание флоэмы. D ) Жук-короед около просверлено отверстие в акрил. E) Использование микроскопа наблюдать флоэмы бутерброд. F) Видео дисплей короедов внутри флоэмы бутерброд.

Рисунок 3. ) приобретение Феромоны от жуков в флоэмы бутерброд. Воздух затягивается через пробирки, содержащие Супер-Q абсорбента. B) записи и воспроизведения звука через пьезоэлектрическим преобразователем (в центре картины) до горных сосновых жуков в флоэмы бутерброд.

Обсуждение

Флоэмы сэндвич позволяет для введения и наблюдения членистоногих, микробов и других мелких организмов, населяющих флоэмы тканей. ^{1,7,8,9,17,18} Эта методика привела к новым открытиям и лучшего понимания поведения, жизненного История черты, развития и взаимодействия организмов внутри дерева флоэмы. ^1,5,10 Протокол сэндвич описано здесь является гибридом последние конструкций, и обеспечит экономичную бутерброд, который легко строится с минимальным оборудованием и материалами. Стеклянные, акриловые или поликарбонатные части могут быть повторно использованы, и только расходные материалы парафильмом и флоэмы.

Хотя все шаги в протоколе важны, определенные шаги должны строго соблюдаться, чтобы обеспечить самую высокую степень успеха. Во-первых, дерево должно быть расположено, что имеет часть ствола свободном или относительно свободным, из ветвей. Деревья, которые имеют много филиалов трудно бриться и будет уIELD несколько жизнеспособных флоэмы штук, а каждая ветвь должна быть обвести при снятии флоэму. Далее, важно, чтобы свести к минимуму воздействие воздуха флоэме. Мы быстро поместить каждую флоэмы часть в сумке при удалении. После 5:57 кусочки отбирают, они передаются в вакуумном мешке уплотнением; мы используем мощности инвертора для запуска герметик от транспортного средства батареи в области. Последнее, дезинфекции акриловых штук и общую чистоту при выполнении этого протокола позволит снизить рост грибков в бутерброде. Это особенно важно для расширенных наблюдений.

Как упоминалось выше, существуют ограничения флоэмы сэндвич аппарата. Поскольку флоэмы слой тонкий, только небольшие организмы, которые обычно остаются в флоэме может быть введен в бутерброде. Более крупные насекомые, такие как древоточцев (т.е. Buprestid, Cerambycid видов) может быть введен и наблюдали в течение ранних стадий своего жизненного цикла. Эти временные рамки, как правило, ограничиваются двумя, чтобытри недели; после этого момента личинки требуют ксилемы древесины в отверстие в течение окукливания. В отличие от этого, для короедов, особенно тех, в роду IPS, полный жизненный цикл можно наблюдать, в том числе спаривания, яйца штриховкой, кормления, окукливания и вылупления во взрослую жука. В этот момент, жизнеспособность сэндвича, как правило, исчерпаны в связи с высыханием и роста грибов. ²⁸ Кроме того, это устройство не позволит насекомым свободно и естественно колонизировать или выхода из флоэмы бутерброд. ²⁷

Наш протокол является гибким с точки зрения размера, формы и типа флоэмы используется. Короткие исследования требуют меньше флоэмы материал и размер сэндвич можно масштабировать соответственно. Многие хвойные породы были использованы в качестве доноров флоэмы в флоэмы сэндвича (например, Пондероса сосны ^12, ель Дугласа ^2, ель ^29, ладанной сосны ^27, Longleaf сосна ^27). Материалы в бутерброде также может быть изменена; для эксширокие стеклянные пластины, может быть использован вместо акриловой и эпоксидной смолы или ленты вместо парафильмом.

Самой трудной частью этого протокола является процесс удаления флоэмы. Деревья рядом друг с другом, могут отличаться в том, как их трудно флоэмы, чтобы удалить. Когда дерево имеет сложную флоэму, терпение имеет решающее значение. В этих случаях, тщательно запустить нож между жестким ксилемы и флоэмы губчатого. Этот процесс чувствует буквально, как шкуры дерево.

После освоения основную технику бутерброда, изменения к протоколу может помочь учетом специфических потребностей. Например, с помощью хонингования приемы, необходимые для удаления флоэмы, крупные куски могут быть удалены и используется для создания больших бутерброды. Кроме того, изменения могут быть сделаны, чтобы разместить конкретные инструменты, например, дополнительные отверстия для контроля химических выбросов (рис. 3а), или запись или воспроизведение звука (рис. 3б). Модификации могут быть сделаны, чтобы обеспечить полу-постоянного сохранения флоэме и его органаизмы, или для временных наблюдений организмов, которые в дальнейшем могут быть отпущены.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls