JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Метка без оптического биосенсора для выявления быстрые бактерий вводится. Биосенсор на основе наноструктурированного пористого Si, которая предназначена для захвата непосредственно в клетки-мишени бактерий на его поверхности. Мы используем моноклональных антител, иммобилизованных на пористую преобразователя, как захвата зондов. Наши исследования показывают, применимость этих биосенсоров для обнаружения низких бактериальных концентрации в течение нескольких минут без предыдущего обработки образцов (например, лизиса клеток).

Аннотация

Метка без оптического биосенсора на основе наноструктурированного пористого кремния предназначен для быстрого захвата и обнаружения кишечной палочки K12 бактерий, как модель микроорганизма. Биосенсор основан на прямое связывание клеток бактерий-мишеней на ее поверхности, в то время как не предварительной обработки (например, путем лизиса клеток) из исследуемого образца не требуется. Мезопористого Si тонкая пленка используется в качестве оптического элемента датчика биосенсора. Под освещении белым светом, пористый слой отображает хорошо решены Фабри-Перо картины полос в ее отражения спектра. Применение быстрого преобразования Фурье (FFT) с результатами данных об отражательной способности в одном пике. Изменения в интенсивности пика FFT контролируются. Таким образом, целевые бактерии захватить на поверхность биосенсора, через антиген-антитело взаимодействия, вызывает измеримые изменения в интенсивности БПФ пиков, что позволяет для «реального времени» наблюдения привязанности бактерий. нт "> мезопористый фильм Si, сфабрикованы электрохимического процесса анодирования, сопряжена с моноклональных антител, специфичных для бактерий-мишеней. обездвиживание, immunoactivity и специфичность антител подтверждены люминесцентных экспериментов маркировки. После того, как биосенсор подвергается целевые бактерии, клетки непосредственно захвачен на антитела с модифицированной поверхностью пористого Si. Эти конкретные записи событий привести к изменениям интенсивности в интерференционной оптической тонкопленочной спектра биосенсора. Показано, что эти биосенсоры могут обнаружить концентрацию относительно низкие бактерий (обнаружение предел 10 4 клеток / мл) в менее чем за час.

Введение

Ранний и точная идентификация патогенных бактерий является чрезвычайно важным для безопасности пищевых продуктов и воды, экологический мониторинг, и точка-в-санитарной диагностики 1. Как традиционные методы микробиологии занимают много времени, трудоемкий, и не имеют способность обнаруживать микроорганизмы в "реальном времени" или вне лабораторных условиях, биосенсоры развиваются для решения этих задач 2-5.

В последние годы, пористый Si (PSI) возник как перспективной площадки для разработки датчиков и биосенсоров 6-20. За последние десять лет многочисленные исследования, касающиеся PSI на основе оптических датчиков и биосенсоров были опубликованы 21,22. Наноструктурированных PSi слой обычно изготавливают путем электрохимического анодного травления от монокристаллического пластины кремния. Полученные PSi наноматериалы проявляют многие выгодные характеристики, такие как большой поверхности и свободного объема, размеры пор, которыми можно управлять и перестраиваемый Optiческих свойств 10,16. Оптические свойства пси слоя, например, ФЛ 8,11 и белый свет отражения на основе интерферометрии 7,19, находятся под сильным влиянием условий окружающей среды. Захват гостевых молекул / целевых аналитов в пористом слоя приводит к изменению среднего показателя преломления пленки, наблюдаемого в качестве модуляции в спектре фотолюминесценции или в виде сдвига длины волны в спектре отражения 10.

Хотя подавляющее инновации в PSi технологии оптического биосенсора, есть только несколько сообщений о пси-платформ для обнаружения бактерий 6,8,20,23-29. Кроме того, большинство из этих доказательств правильности концепции исследований продемонстрировали "косвенное" обнаружение бактерий. Таким образом, как правило, до лизиса клеток требуется для извлечения целевых фрагментов белка / ДНК, характерные для исследованных бактерий 29. Наш подход заключается в непосредственно захватить целевые бактерииклетки на PSi биосенсора. Таким образом, моноклональные антитела, которые являются специфическими для целевой бактерии, обездвижены на пористой поверхности. Связывание бактериальных клеток, с помощью антиген-антитело взаимодействий, на поверхность биосенсора вызывать изменения амплитуды (интенсивность) отражательной спектра 24-26.

В этой работе мы сообщаем о строительстве оптического PSi основе биосенсора и продемонстрировать свое применение в качестве метки без биодатчиков платформы для обнаружения кишечной палочки (E.coli) K12 бактерии (используемые в качестве модельного микроорганизма). Мониторинг оптический сигнал свет, отраженный от пси наноструктуры из-за Фабри-Перо тонкопленочного помех (рис. 1А). Изменения в светло-амплитудной / интенсивности коррелируют с определенной иммобилизации клеток бактерий-мишеней на поверхность биосенсора, что позволяет для быстрого обнаружения и определения количества бактерий.

протокол

1. Подготовка окисленного пористого SiO 2

  1. Травления Si пластин (одной боковой отполирован с <100> поверхности и сильно легированного, р-типа, 0,0008 Ω · см) в 3:1 (объем / объем) раствор водного HF и абсолютного этанола в течение 30 сек при постоянном токе плотность 385 мА / см 2. Пожалуйста, обратите внимание, что ВЧ является весьма агрессивная жидкость, и это должны быть обработаны с особой осторожностью.
  2. Промыть поверхность полученного пористого Si (PSI) пленки с абсолютным этанолом несколько раз; сухой пленки под сухим азотом.
  3. Окисления свежих выгравированные образцы PSI в трубчатой ​​печи при 800 ° С в течение 1 часа в атмосферном воздухе (поместите образец в печи при комнатной температуре, разжечь печь до 800 ° С, оставить в печи в течение 1 часа, выключите печи и удалить образцы из печи только при комнатной температуре).

2. Biofunctionalization из PSIO 2 Строительные леса

  1. Выдержите окисленного PSi (PSIO 2) образец в течение 1 часа в меркаптопропил триметоксисилан (С-3) 95% (MPTS) раствора (108 мМ в толуоле).
  2. Промыть силана обработанных PSIO 2 образца с толуолом, метанола и ацетона; сушили под сухим азотом.
  3. Инкубируйте модифицированного силаном PSIO 2 образец в течение 30 мин в 1 мл 100 мМ ПЭО-иодоацетил раствора биотина.
  4. Промыть биотин-обработанных PSIO 2 образца с 0,1 М фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) в несколько раз.
  5. Инкубируйте биотин-модифицированный PSIO 2 образец в течение 30 мин в 1 мл 100 мкг / мл стрептавидин раствора (SA).
  6. Промойте SA-обработанную PSIO 2 образца с 0,1 М PBS решения в несколько раз.
  7. Инкубировать в результате SA-модифицированный PSIO 2 образец в течение 30 мин в 1 мл 100 мкг / мл биотинилированного Е. Раствор палочка моноклональное антитело (иммуноглобулин G, IgG) или с 100 мкг / мл биотинилированного IgG кролика (в качестве модели для моноклонального антитела).

3. Флуоресцентная маркировка и флуоресцентной микроскопии

  1. Инкубируйте IgG-модифицированных поверхностей с 15 мкг / мл флуоресцеин (FITC) меченый анти IgG кролика в течение 40 мин и с 15 мкг / мл флуоресцеин (FITC) меченый анти IgG мыши в качестве контроля.
  2. Промыть измененные образцы с 0,1 М PBS решения в несколько раз.
  3. Изучите образцы под флуоресцентным микроскопом.

4. Бактерии Культура

  1. Развивайте E. E.coli К12 бактерии в 10 мл пробирку с 5 мл Луриа Бертани (LB) среды (состав среды в 1 л деионизированной воды: 5 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г триптона). Выдержите бактерии ночь встряхивании при 37 ° C.
  2. Контролируйте концентрацию бактерий, читая оптическую плотность (OD) при длине волны 600 нм. После ночного роста в LB среде, читать OD 600 с использованием спектрофотометра для определения концентрации бактерий. Число клеток является очень тяжелымctly пропорциональны OD 600 измерений (1 OD 600 = 10 8 клеток / мл).

5. Бактерии зондирования

  1. Поместите IgG-модифицированный PSIO 2 и аккуратный PSIO 2 (в качестве контроля) образцов в заказ проточную ячейку оргстекла. Закрепить проточную кювету для того, чтобы образец отражательная способность измеряют в том же месте во время всех измерений.
  2. Инкубируйте образцы с E. палочки K12 подвеска (10 4 клеток / мл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем удалить суспензию бактерий путем промывки клетки с 0,85% вес / объем физиологического раствора в течение 30 мин.
  3. Монитор изменения в данных отражательной в течение всего эксперимента. Все оптические измерения должны быть проведены в водном окружении. Спектры должны быть собраны с использованием CCD-спектрометра и анализировали с применением быстрого преобразования Фурье (FFT), как описано ранее 25,26.
  4. Подтвердите наличие бактерий набиосенсора поверхность, при наблюдении образцов вертикальном под световым микроскопом сразу после эксперимента биодатчиков.

Результаты

Окисленный дюйм (PSIO 2) пленки получают, как описано в разделе Текст протокола. Фиг.1В показана с высоким разрешением сканирующего электронного микроскопа в результате PSi пленки после термического окисления. Слой PSIO 2 характеризуется четко определенных цилиндрическ?...

Обсуждение

Метка свободного оптического иммуносенсор, на основе PSIO 2 наноструктуры (тонкая пленка Фабри-Перо) изготовлен, и его потенциал применимость в качестве биосенсора для обнаружения бактерий подтверждается.

Изменения и устранение неисправностей

Одна и?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Израильской научного фонда (грант № 1118/08 и грант № 1146/12) и Kroll исследовательского фонда Минна Мемориал. ES выражает благодарность за финансовую поддержку Рассела Berrie нанотехнологий института.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluteMerck818760
PBS buffer solution (pH 7.4)prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/vprepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidinJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinylated-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinylated E. coli antibodyJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

Ссылки

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

81Si

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены