Установление минимальной бактерицидной концентрации противомикробного агента для планктонных клеток (MBC-P) и биопленочные клетки (MBC-B)

Резюме

Этот протокол позволяет проконтриктное и биопленоконное сопротивление бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro с помощью 96-ну микротитрной пластины. Планктонные или биопленопленовиты подвергаются серийным разбавлениям противомикробного агента по выбору. Жизнеспособность можно посвястить росту на агарных пластинах.

Аннотация

Этот протокол позволяет пропрямить сопротивление планктонного и биопленки бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro. Бактерии прививаются в колодцы 96-ну микротитр пластины. В случае планктонного анализа к бактериальным суспензиям добавляются серийные разбавления противомикробного агента по своему выбору. В анализе биопленки, после прививки, бактерии остаются для формирования биопленки в течение определенного периода времени. Из колодцев удаляются незакрепленные клетки, пополняются средства массовой информации и добавляются серийные разбавления антимикробного агента по выбору. После воздействия противомикробного агента, планктонные клетки проецированы для роста. Для анализа биопленки, средства массовой информации обновляется со свежими средствами массовой информации не хватает противомикробного агента и биопленки клетки остаются для восстановления. Жизнеспособность биопленоплено-клеток анализуется после периода восстановления. MBC-P для противомикробного агента определяется как самая низкая концентрация препарата, который убивает клетки в планктонной культуре.  В отличие от этого, MBC-B для штамма определяется путем подвергая предварительной биопленки для увеличения концентрации противомикробного агента в течение 24 часов. MBC-B определяется как самая низкая концентрация противомикробного агента, который убивает клетки в биопленки.

Введение

Анализ устойчивости к антибиотикам был первоначально разработан для анализа устойчивости планктонных (свободно плавающих) культур бактерий. Поскольку многие бактериальные инфекции связаны с биопленкой (поверхностными клетками), мы были заинтересованы в разработке метода анализа биопленки-специфической устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, большинство анализов устойчивости к антибиотикам плохо подходят для измерения устойчивости биопленок. Например, определение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) является золотым стандартом для определения устойчивости к антибиотикам планктонных бактериальных культур ^1. Этот анализ влечет за собой смешивание разбавленной планктонной культуры с разбавляя ряд антибиотиков.  Концентрация антибиотика, который подавляет видимый рост планктонных клеток является MIC. Поскольку этот анализ опирается на ингибирование роста, по определению, он не может работать с культурами биопленки, что требует изучения чувствительности клеток к антибиотикам в предварительной биопленки. Вместо измерения ингибирования роста, анализ MBC-B, описанный здесь, определяет концентрацию антибиотика, который убивает клетки, уже существующие в биопленки. Таким образом, этот анализ направлен на имитацию лечения антибиотиками установленных биопленоплено инфекций, и обеспечить более релевантное представление о бактериальной устойчивости к антибиотикам in vivo.

Поскольку биопленки, как правило, более устойчивы к ^{антибиотикам, чем планктонные культуры 2-4,} необходимо было разработать метод, который непосредственно связывает устойчивость к антибиотикам биопленки с планктонной культурой. Таким образом, еще одна цель этого метода заключается в том, чтобы иметь возможность напрямую сравнить уровень устойчивости к антибиотикам между планктонными и биопленочные клетки. Анализы MBC-P и MBC-B, описанные здесь, делают это возможным, потому что клетки культуризуются в аналогичных условиях. Мы использовали этот метод для изучения нескольких генов, которые имеют важное значение для биопленки конкретных устойчивости к ^{антибиотикам 5-8} .

протокол

1. MBC-B

1. Выращивание биопленки (адаптировано от O'Toole⁹).
   1. Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
   2. Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1). Эта среда стимулирует образование более надежной биопленки.
   3. Добавьте 100 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
   4. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
2. Воздействие предварительной биопленки на градиент концентрации антибиотиков
   1. Приготовьте 10-х разбавляя ряд антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, и 0,006 мг / ^{мл 5-8} . Из бульона 25 мг/мл приготовьте 10x разбавления 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 и 0,06 мг/мл. Оставьте на льду.
   2. Удалите оттягченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки (см. таблицу 1).
   3. Добавьте 90 хл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
   4. Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
   5. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
3. Обновление средств массовой информации и предоставление отряда живых клеток.
   1. Удалите оттяченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки.
   2. Добавьте 115 мкл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
   3. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
4. Анализ живых клеток.
   1. Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
   2. Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
   3. Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
   4. Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрез для роста бактерий(рисунок 1).

2. MBC-P

1. Подготовка бактериальных штаммов
   1. Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
   2. Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1).
   3. Добавьте 90 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
2. Воздействие планктонных клеток на концентрационный градиент антибиотиков
   1. Подготовка 10x разбавления серии антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 и 0,0005 мг/мл. Из бульона 25 мг/мл, подготовить разбавления 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 и 0,005 мг/мл. Оставьте на льду.
   2. Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
   3. Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
3. Анализ живых клеток.
   1. Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
   2. Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
   3. Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
   4. Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрезанный для роста бактерий(рисунок 2).

Результаты

Были проведены анализы MBC-P и MBC-B, сравнивая чувствительность дикого типа PA14 с PA14 ∆ndvB. Тобрамицин использовался в качестве антибиотика. Представлены результаты, соответствующие шагу 1.4.4(рисунок 1)и шагу 2.3.4(рисунок 2). PA14 и ∆ndvB были привиты в MBC-P и MBC-B анализы в тр...

Обсуждение

Устойчивость к антибиотикам в планктонных клетках определяется как увеличение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) антибиотика из-за постоянного изменения клеток(например, мутации). Выявленные на сегодняшний день механизмы биопленки или толерантности являются результат...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate