Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для<em&gt; На месте</em&gt; 3D Mapping бактериальных биопленок физических свойств

Резюме

В данной работе показано оригинальную методологию, основанную на пульте дистанционного приведения в действие магнитных частиц, посеянных в бактериальной биопленки и развитие специализированных магнитных пинцетом для измерения на месте местные механические свойства комплексной жилой материала построен микроорганизмов на границах.

Аннотация

Бактериальной адгезии и роста на интерфейсах привести к образованию трехмерных гетерогенных структур так называемых биопленки. Клетки, живущие в этих структурах скрепляются физических взаимодействий, опосредованных сети внеклеточных полимерных веществ. Бактериальные биопленки влиять на многие виды деятельности человека и понимание их свойств имеет решающее значение для лучшего контроля их развития - сохранение или ликвидация - в зависимости от их отрицательное или положительное исходом. Эта статья описывает новую методологию, направленную для измерения на месте местные физические свойства биопленки, которая была, до сих пор рассматривалось только от макроскопического и однородного материального точки зрения. Эксперимент, описанный здесь включает введение магнитных частиц в растущую биопленки, чтобы отобрать местные зондов, которые могут быть дистанционным управлением, не нарушая структурные свойства биопленки. Выделенные магнитные пинцет были развивприпрыжку приложить определенное усилие на каждой частице, встроенного в биопленки. Установка монтируется на этапе микроскопом, чтобы включить запись покадровой изображений на период частиц потянув. Траектории частиц затем извлекают из тянущего последовательности и местные вязкоэластичные параметры выводятся из каждой кривой частиц смещения, тем самым обеспечивая 3D-пространственное распределение параметров. Получение взглянуть на биопленки механической профиль имеет важное значение с точки инженера зрения для целей контроля биопленки, но и с фундаментальной точки зрения, чтобы уточнить связь между архитектурными свойствами и конкретного биологии этих структур.

Введение

Бактериальные биопленки сообщества бактерий, связанных с биологическими или искусственных поверхностей ^1-3. Они образуют с помощью механизма адгезии роста в сочетании с производством полисахарида богатых внеклеточного матрикса, который защищает и стабилизирует здание ^4,5. Эти биопленки не просто пассивные комплексы клеток, застрявших на поверхности, но организовал и динамические сложные биологические системы. Когда бактерии переключаться с планктонных в биопленки образа жизни, изменения в экспрессии генов и клеточной физиологии наблюдаются, а также повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам и провести иммунную защиту будучи в начале многих стойких и хронических инфекций ^6. Тем не менее, под контролем развитие этих живых структур также предлагают возможности для промышленных и экологических применений, таких как биоремедиации мест захоронения опасных отходов, био-фильтрации технической воды или образования био-барьеров для защиты почвы и грунтовых вод от разлиAtion.

В то время как молекулярные особенности, характерные для биопленки образа жизни все чаще описываются механизмы, способствующие развитию развитию общин и упорство остаются неясными. Используя последние достижения на микромасштабных измерений с использованием сканирования электрохимические или флуоресцентной микроскопии, эти живые организации было показано, обладает значительным структурным, химической и биологической гетерогенности ^7. Тем не менее, до сих пор, механика биопленки не были в основном рассмотрены макроскопически. Например, наблюдение биопленки стримеров деформации из-за различий в жидкости расхода ^8,9, одноосное сжатие биопленки штук поднять из агаровой среде или выращивают на покрытие скользит ^10,11, сдвиг биопленки, собранной из окружающей среды, а затем перевели в параллельный пластина Реометр ^12,13, атомно-силовая спектроскопия с использованием бусины и покрытием с бактериальной биопленки, прикрепленной к АСМ кантилевера ¹⁴ или выделенной микрocantilever метод измерения прочности на разрыв отдельные фрагменты биопленки ^15,16 были реализованы в течение десяти последних лет, предоставляя полезную информацию о вязкоупругой природы материала ^17. Тем не менее, вполне вероятно, что информация о в точке биопленки механических свойств теряется, когда материал будет удален из его родной среде, которая была часто бывает в этих подходов. Кроме того, лечение биопленки в виде однородного материала попадает в информацию о возможном неоднородности физических свойств в обществе. Таким образом, точные последствия механике структуры в формировании биопленок и биологических черт, таких как экспрессии генов паттерна или химических градиентов вряд ли могут быть признаны. Для продвижения к микромасштабной описания биопленки физических свойств, новые специализированные инструменты необходимы.

Эта статья подробно оригинальный подход задуман для достиженияизмерение локальных механических параметров в месте, не нарушая биопленки и позволяет чертеж пространственного распределения микромасштабных свойств материала, а затем механической неоднородности. Принцип эксперимента опирается на легирования растущей биопленки с магнитными микрочастицами с последующим их удаленной загрузки с использованием магнитных пинцетом в зрелом биопленки. Смещение частиц при контролируемой магнитной силовой применения отображаемого под микроскопом позволяет местным вывод параметров вязкоупругих, каждую частицу отчетности собственную локальную среду. Исходя из этих данных, 3D механический профиль биопленки можно сделать, открыв пространственных и экологических условий зависимости. Весь эксперимент будет показано здесь на Е. палочка биопленки сделаны генной инженерии штамм, несущий derepressed F-как плазмиды. Результаты подробно изложены в недавней работе ¹⁸ обеспечивают уникальное видение интерьера интактных механики биопленки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Бактерии Культура и подготовка Подвеска

1. Выберите только что выращенного колонию из чашки с агаром лизогении бульон (LB), привить его в 5 мл жидкость LB среду, содержащую 100 μ г / мл ампициллина и 7,5 μ г / мл тетрациклина и инкубировать в течение 5 до 6 часов при 37 ° С на встряхивая платформы.
2. Затем добавляют 100 μ л бактериальной культуры в 5 мл минимальной среды (M63B1) с добавлением 0,4% глюкозы и тех же концентраций антибиотика. Инкубируйте этот разбавленный недавно культуры в течение ночи при 37 ° С на качалке платформы.
3. После 16 часов инкубации, добавьте 100 мкл ночной культуры в 5 мл M63B1, 0,4% глюкозы. Хранить трубку при 37 ° С в качалке платформы до 0,5 OD будет достигнута. Затем суспензию готов к инъекции в эксперименте канала для образования биопленки.

Подготовка 2. Магнитных частиц

1. Возьмите 10 мкл магнитных частиц -2,8 μ м в диаметре - со склада и мыть их 3x в 190 мкл минимальной среды с помощью магнитного образца стойке.
2. Отрегулируйте концентрацию частиц до 5 х 10 ⁶ бисером / мл. Обычно 50 мкл промытого раствора борта смешивают с дополнительным 950 μ л M63B1 с 0,4% глюкозы.

3. Подготовка канала и биопленки роста

1. Монтаж канала
   1. Вырежьте два квадратных (800 μ м длина стороны) боросиликатного стекла капилляров длиной 10 см, чтобы получить длинные два 8 см кусочки.
   2. Приклейте две капиллярные штук на двух стеклах - разрезать пополам сначала - 2 см друг от друга с 1 см навеса на любом конце, как на рисунке 1 с помощью быстродействующего цианакрилатный клей (так называемый супер-клей).
   3. Автоклав всю установку и необходимую трубы, необходимую для дальнейшей связи канала.
   4. Соберите все стерильные материалы подламинарный поток капот: я) установлен канал и ловушки 1, II) трубы и соединители, III) два пузырь ловушки - пузырь фильтр, обычно используемые для обеспечения детский капельного вскармливания (ловушки 1) и самодельный пузыря ловушку как долго 4 см трубы большего диаметра (ловушки 2), внутривенно) зажимы, объем) 30 мл шприцы, наполненные M63B1, 0,4% глюкозы, и VI) бутылки отходов.
   5. Подключите всю установку с Луер блокировки связкой или переходов в следующем порядке: 50 мл M63B1 шприца контролируется шприцевой насос, педиатрической фильтра пузыря, домашний пузыря ловушку, капиллярной (рис. 1, панель B), и через трубу к бутылке отходов. Затем заполнить установку стерильной M63B1, 0,4% глюкозы, включение шприцевого насоса со скоростью примерно 10 мл / ч, выше экспериментальных ставок. Тщательно отслеживать и устранять все пузыри в цепи.
   6. Расход среды через систему в течение 10-15 минут; одновременно смешивать 1 мл бактерий суспензии при OD 0,5 из раздела1.3 1 мл промытого борта раствора, приготовленного в разделе 2.2.
   7. Прикрепите (но не закрывайте) зажимы для трубок в двух положениях: до и после капилляров. Переключите поток прочь.
   8. Введем бактериально-шарик смеси в капилляр после самодельным пузыря ловушку, используя 1 мл шприц, заботясь, чтобы задержать концов труб, чтобы предотвратить попадание воздуха. Повторно прикрепить трубку и закройте зажимы.
   9. Повторите ту же процедуру для второго капилляра и проверить все трубы для пузырьков.
   10. Перенести аппарат к микроскопу и дайте ему постоять в течение 15-20 мин, чтобы позволить бактерии урегулировать и приложить к поверхности капилляра. Установите капилляр на столике микроскопа с контейнером отходов на более высоком уровне. Поместите шприцевой насос на рабочей поверхности рядом с микроскопом. Поднимите пузыря ловушку перед капилляра несколько выше, чем капиллярной плоскости захватить пузыри.
2. Биопленки Грут-й
   1. Отрегулируйте расход на шприцевой насос и начать поток, биопленки теперь развиваются на поверхности капилляров в необходимый период - как правило, 24 или 48 ч в этих экспериментах.
   2. Сосредоточьтесь на капиллярной нижней плоскости и начать запись покадровой из примеров изображений - обычно частоты приобретение 2 изображений / мин будет адекватно сообщить рост биопленки. Это видеомониторы биопленки роста после управления (см. выдержки в Видео 1, 2 и 3).

4. Магнитные Пинцет Установка

1. Винтовые магнитные пинцет на управляемых вручную XYZ микроманипуляторов и закрутите микроманипуляторами на столик микроскопа, чтобы отрегулировать положение пинцета относительно капилляра. Поместите пинцет как на рисунке 2, чтобы обеспечить соответствующий градиент магнитного поля генерируется в зоне наблюдения.
2. Подключите пинцет Tо функции генератора через усилитель мощности для генерации 40 сек период времени, изготовленный из 24 сек нулевого сигнала и 16 сек 4 постоянного тока с триггером послал к яркому поля световой затвор после 20 сек для синхронизации сигнала обеспечивая последовательность события, как на рисунке 3.
   Примечание: Эти две операции могут быть достигнуты в любое время между капиллярной установки и начала измерения. Смотреть экспериментировать обзор эскиз на рисунке 4.

Creep Кривая Приобретение 5.

1. Используйте регулятор движения ху из столике микроскопа, чтобы принести край левой магнитного полюса и левого края капилляра в той же области наблюдения. Возьмите происхождение анализа ссылочной на пересечении рентгеновских и у-осей, определенных краю капилляра и краю полюса, соответственно (см. рисунок 2).
2. Отрегулируйте вертикальное положение капилляра с помощью тонкой Focus Control ручка от положения микроскопа. Как правило, первый рассмотрены самолет находится от 4 до 7 μ м над капиллярной дне. Видео 1 соответствует ху области, который имеет свой ​​верхний левый угол в начале пространственной ссылочной.
3. Trigger последовательность 40 сек событий, описанных в разделе 4.2 и на рисунке 3, включив генератора тока и в то же время, вручную запустить последовательность получения изображений из видео 1.
4. Перемещение капилляр в правом поле соседа по 250 μ м переводе столик микроскопа слева и работать как в разделе 5.3 для создания видео 2 срез 2 и так далее до получения требуемых видео. Как правило от 3 ​​до 4 поля 250 х 250 μ м ² собирают вдоль оси х перед изменением плоскости и повторяя те же операции для новой плоскости.

6. Силы Калибровка

1. Приготовьте раствор глицерина путем смешивания 39,8 г глицерина с 190 μ л бидистиллированной воды и 10 мкл магнитных частиц на 2 х 10 ⁹ частиц / мл и заполнить экспериментальный канал с этой смесью и поместить его на столик микроскопа , как описано для образца биопленки.
2. После установки магнитных пинцет, как указано в разделе 4, применять магнитную силу, как указано в разделе 5.4 и сделать покадровой изображения для извлечения каждый скорость одной частицы (V) и его положение в капилляр, чтобы получить файл калибровки. Этот файл должен содержать приложенной силы в зависимости от его положения в зоне анализа капилляра в соответствии с Стокса закона, F = 6πRηv (R: радиус частицы).

7. Анализ

1. Используйте программное обеспечение "частица трекер" для получения текстовых файлов с позициями частиц в каждом кадре для всех стеков изображений, полученных, как указано в разделе 5. Усинг частота приобретение стек изображение, вычислить смещение частиц в виде функции времени (например, рисунок 5 и видео 4).
2. Использование файла калибровки силы, конвертировать кривые смещения в кривых соблюдения (всего соблюдения материала - J (т) - в зависимости от времени) по формуле соответствия:
   
   который дает связь между материальной процедить и приложенное напряжение для пробной частицы радиуса R, встроенного в несжимаемой, однородной вязкоупругой среды в порядке, установленном ранее Schnurr с сотрудниками ^19.
3. Отрегулируйте кривые на соблюдение норм ползучести для широкой Бюргерса модели вязкоупругих материалов и получить вязкоупругие параметры, J _0, J _1, η _0, η ₁ для каждой частицы ( Рис. 6) в соответствии с формулой Бюргерса:
   
   Примечание: Этот феноменологический анализ был ранее использован для широкого спектра материалов, включая биологических материалов, таких как биопленки интерпретировать макроскопических СВЕДЕНИЯ реологии ^20-22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Типичный анализ даст пространственное распределение вязкоупругих параметров на микрон шкалой на живого биопленки, не нарушая его оригинальное расположение. Типичные результаты приведены на рисунке 7, где значения J ₀ - упругой податливости, - приводятся в зависимости от ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Это магнитная частица посева и потянув эксперимент включен на месте 3D отображения вязкоупругих параметров растущего биопленки в исходное состояние. Этот подход показал механическую неоднородность Е. палочка биопленки вырос здесь и дал ключи, чтобы указать на компоненты био...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin