Первичная ортопедическая Глиома Ксенотрансплантирует резюмировать инфильтративный рост и изоцитрат дегидрогеназы I Мутация

Резюме

Злокачественные глиомы представляют собой неоднородную группу высокоинфильтративных глиальных неоплазм с различными клиническими и молекулярными особенностями. Первичные ортопедические ксенотрансплантологии подтипы гистопатологических и молекулярных новообразований в доклиниковых моделях животных.

Аннотация

Злокачественные глиомы представляют собой неоднородную группу высокоинфильтративных глиальных неоплазм с различными клиническими и молекулярными особенностями. Первичные ортопедические ксенотрансплантологии подтипы гистопатологических и молекулярных новообразований в доклиниковых моделях животных. Для моделирования ВОЗ III и IV классов злокачественных глиом в трансплантации анализы, человеческие опухолевые клетки ксенотрансплантированы в ортопедическое место, мозг, иммунокомпромиссных мышей. В отличие от вторичных ксенотрансплантатов, которые используют культурные опухолевые клетки, клетки глиомы человека отмежеваются от ресектированных образцов и пересажены без предварительного прохождения в культуре тканей для генерации первичных ксенотрансплантатов. Процедура в этом отчете детали подготовки образца опухоли, внутричерепной трансплантации в иммунокомпромиссных мышей, мониторинг для опухолевого прихлатения и опухоли сбора для последующего прохождения в реципиент животных или анализа. Препарат опухолевых клеток требует 2 часа, а хирургическая процедура требует 20 мин/животное.

Введение

Злокачественные глиомы являются первичными глиальными опухолями центральной нервной системы, которые возникают в головном мозге, а иногда и спинном мозге. Глиомы классифицируются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в соответствии с гистологическим сходством с астроцитами, олигодендроцитами или эпендимальными клетками, а затем численно градуированы (от I до IV) на патологические особенности злокачественности. Наиболее распространенными гистологическими подтипами являются астроцитомы, олигодендроглиомы и смешанные олигоастроцитомы. Злокачественные глиомы, охватывающие II-IV классы ВОЗ, характеризуются инвазивным ростом и непокорностью современных методов лечения. Каждый год в Соединенных Штатах, около 15750 человек с диагнозом злокачественной глиомы и, по оценкам, 12740 пациентов поддаются этому заболеванию. Эти статистические данные подчеркивают особенно смертоносный характер злокачественных глиом и важную потребность в повышении терапевтической эффективности.

Модели рака имеют важное значение для изучения биологии опухолей и терапии. Линии раковых клеток человека представляют собой важный первый шаг для манипуляций в пробирке и исследований ксенотрансплантации виво (вторичные ксенотрансплантаты)^1. Тем не менее, стандартные культуры раковых клеток проходят фенотипические и генотипические^{преобразования 2-4,} которые не могут быть восстановлены во вторичных ксенотрансплантатах^5. Кроме того, генетические изменения, такие как изоцитратдегидрогеназы( IDH )^{мутации 6}, различные популяции^{стволовых клеток 7} и зависимость от ключевых^{сигнальных путей 8 могут быть} потеряны в культурах раковых клеток. Геномные профили могут быть сохранены в большей степени в культуре сферы рака, хотя все еще не в состоянии полностью отразить генотип^{первичных опухолей 2,3}. Прямая ортотопическая трансплантация сводит на нет влияние культуры in vitro, обеспечивает надлежащую микроокноронику и сохраняет целостность опухолевых инициируя^{клеток 9,10}. Таким образом, первичные ксенотрансплантанты представляют собой мощную и соответствующую доклиническую модель для тщательного тестирования целевых агентов, чтобы помочь в рациональном^{дизайне будущих клинических испытаний 5,11,12}.

протокол

1. Подготовка подвески опухолевых клеток

Примечание: Для установления и поддержания первичных ортотопических глиом ксенотрансплантатов необходимы соответствующие институциональные разрешения на использование материалов и животных пациентов. В медицинском центре Университета Вандербильта с согласия пациента собирается ресектирован опухолевый материал, превышающий тот, который необходим для диагностических целей. Specimens помечены рандомизированным 5-значным номером базы данных REDcap и все идентификаторы пациента удаляются. База данных REDcap содержит опоясывающие клинические данные по каждому экземпляру в репозитории тканей, которые включают пол, возраст (в годах), расу, статус выживания, патологию, лечение рака, год ресекции и время для прогрессирования. Для поддержания стерильности и оптимизации успеха первичного метода ксенотрансплантата все реагенты, паровые хирургические инструменты и хирургическое отделение должны быть собраны или подготовлены заранее.

Примечание: Образцы Глиомы часто содержат большое количество миелина и мусора. В зависимости от размера образца, может потребоваться использовать более 4 прерывистых градиентных труб для адекватного удаления миелина и мусора.

Примечание: Процесс завершается, когда нет, или мало, четко видны несоциированные ткани, оставшиеся. Избегайте введения пузырьков во время процесса тритурации.

Примечание: Жизнеспособность клеток после диссоциации, как правило, >90%. Более низкие viabilities могут отразить много переменных включая suboptimal обработку ткани или время перевозки от операционной комнаты, метода криоконсервации, или метода диссоциации папаина. Однако более низкая виабильности клеток может быть адекватной до тех пор, пока достаточное количество жизнеспособных может быть пересажено в соответствующем объеме. Для каждой мыши имплантируется 50 000-200 000 жизнеспособных клеток объемом 2 мл. Из-за скошенного кончика шприц-иглы, дополнительные 5 мкл клеточной суспензии должны быть включены в окончательный объем для обеспечения того, чтобы адекватный материал может быть втянут в шприц для каждой инъекции. Например, для введения 2 мкл/мышь для 5 мышей конечный объем должен быть 15 мкл (15 мкл) (5 х 2 мл) и 5 мкл).

1. Поместите свежеотбранный, идентифицированный материал пациента в стерильный, ограниченный контейнер на льду для транспортировки в лабораторию. Обработать образец непосредственно для трансплантации или криопресерв образца в жидком азоте (см. ниже) для хранения в жидком азоте, а затем использовать.
2. Подготовьте растворы диссоциации папаина (раствор папаина, раствор ингибитора мытья/протеазы и раствор прерывистого градиента) в стерильном капюшоне с компонентами комплекта и инструкциями, предоставленными производителем. Этикетка стерильные 15 мл полистирола конические трубки и распространять решения следующим образом:
   • Трубка 1: 5 мл раствора папаина
   • Трубка 2: 3 мл раствора ингибитора мытья/протеазы
   • Трубы 3-6: 5 мл каждого из прерывистого градиентного раствора
3. Поместите образец глиомы в трубку 1 с 5 мл раствора папаина и тритурата с 5 мл пипетки в течение 10-20 минут периода времени.
4. Pipette материал вверх и вниз 10 раз, а затем инкубировать материал в течение 2-3 минут при комнатной температуре, прежде чем инициировать следующий цикл тритурации.
5. Распоить кончик 5 мл пипетки ближе к нижней части конической трубки с каждым циклом тритурации таким образом, что кончик касается нижней части трубки в течение последних 2 циклов.
6. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и пипетку гранулы вверх и вниз 10x в 3 мл раствора ингибитора мытья / протеазы.
7. Тщательно слой равный объем подвески над каждым из 5 мл прерывистый градиент решений (трубы 3-6), с пипетки, установленные на "гравитации" обойтись скорость.
8. Поместите трубки в центрифугу, оснащенную качающихся ковшом ротора, с ускорением скорость снижена до самой низкой настройки и тормоз выключен. Центрифуга при температуре 76 х г в течение 12 мин при комнатной температуре. С выключенным тормозом центрифуга, как правило, завершается через 20 минут.
9. Удалите супернатант, рсуспенденные и объединить каждую гранулу в 5 мл стерильного сбалансированного раствора соли и поместить клетки на лед.
10. Удалите часть (10-100 мкл) клеточной подвески и определите плотность жизнеспособных клеток путем трипан-голубого исключения с помощью гемоцитометра.
11. Центрифуга по 300 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы при плотности 25 000-125 000 жизнеспособных клеток на йл.
12. Перенесите достаточный объем клеточной подвески в микроцентрифугную трубку (ПЦР-трубку) и поместите на лед.

2. Подготовка хирургического сайта и инструментов

Примечание: Во время процедуры носят стерильные хирургические перчатки. В зависимости от требований каждого учреждения, хирургические платья, шапки и лица охранников может потребоваться.

1. Подготовьтесь к дезинфицированной скамейке для операции на грызунах с разделенными прилегающими участками для приготовления животных, эксплуатации поля и восстановления животных.
2. Стерилизовать хирургические инструменты в паровом автоклаве. Впоследствии используйте стерилизатор горячего бисера для флэш-стерилизации инструментов при переходе от одного животного к следующему.

3. Индукция, анестезия и анальгезия

Примечание: Операции, превышающие 15 минут с времени анестезии мышей требуют контактного источника тепла. Чтобы предотвратить переохлаждение, мышам предоставляется источник тепла (циркулирующее одеяло горячей воды) в до- и послеоперационный периоды.

1. Приготовьте кетамин/ксилазин для индукционной анестезии, чтобы каждая мышь получила кетамин 100 мг/кг и ксилазин 10 мг/кг путем введения 10 мл коктейля на грамм массы тела.
2. Таблица 1. Коктейль анестезии.

   	Концентрация запасов	Объем для подготовки к
   		одна мышь	пять мышей	десять мышей
   Кетамин	100 мг/мл	25 хл	125 хл	250 мкл
   Ксилазин	100 мг/мл	2,5 мл	12,5 мл	25 хл
   Изотонический солевой раствор		223 хл	1113 кл	2225 мкл
   итог		250 ул.	1250 мкл	2500 мкл

3. Приготовьте кетопрофеновый раствор для анальгезии, разбавляя раствор бульона (10 мг/мл) 1:20 стерильной, без pyogen водой, чтобы каждая мышь получила дозу 5 мг/кг путем введения 10 мкл раствора на грамм массы тела.
4. Взвешивание и запись предургического веса. Индивидуальные веса мыши различаются, но обычно варьируются от 18-22 г.
5. Ввпрыснуть 10 мкл кетамина/ ксилазина коктейль на грамм массы тела мыши в внутриперитонеамном пространстве с инсулиновым шприцем. Например, ввись 200 мкл для мыши 20 г.
6. Определите, является ли мышь полностью анестезирован ногой щепоткой задней ноги. Как правило, это занимает 3-5 минут для мыши больше не выйти из щепотки.
7. Ввините 10 мкл кетопрофенового раствора на грамм массы тела мыши подкожно в рыхлую кожу фланга с помощью инсулинового шприца. Например, ввись 200 мкл для мыши 20 г.
8. Бритье волос над черепом с клиперами, скраб подвергаются скальп с povidone-йод с помощью хлопка наконечник аппликатора, а затем протрите спиртовой площадке. Повторите эти шаги, povidone йод скраб и спиртовой салфетки, еще два раза.
9. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
10. Сделайте разрез средней линии 1 см, простирающийся из-за ушей прямо перед глазами стерильным скальпельовым лезвием.
11. Поместите мышь под область вскрытия и разоблачить череп, чтобы определить линии шва. Используя круговые движения с дрелью, центр заусенцев отверстие 2,5 мм боковой к брегме и 1 мм задней корональной шва.

4. Внутричерепная трансплантация

Примечание: Объемы инъекций, превышающие 2,5 мкл, могут быть смертельными для мышей.

1. Распоистите мышь на стереотаксической раме, зацепив верхние резцы над резцом и применив зажим для носа так, чтобы череп прочно удерживался в нейтральном положении.
2. Нарисуйте 5-10 мкл клеток в микроцентрифуг трубки вверх и вниз несколько раз в 10 мкл Гамильтон шприц зажат в зонде держатель стереотаксического манипулятора, чтобы смешать подвеску и устранить пузырьки. Угнетать поршень так, чтобы шприц загружался 2 мл (адекватный объем для инъекций одного животного).
3. Потяните боковой край разреза кожи, чтобы разоблачить отверстие заусенцев и, с микроманипулятором, ввести иглу в отверстие заусенца так, чтобы скошенная часть была чуть ниже поверхности черепа.
   1. Заранее иглы 3 мм, а затем снять иглу 0,5 мм, чтобы создать пространство для инъекций.
   2. Заранее поршень медленно более 30 сек, а затем позволить иглы оставаться в мозге в течение дополнительных 2 минут. Свяжте иглу постепенно, поднимаясь на 0,5 мм и ожидая дополнительных 30 сек, прежде чем удалить иглу из мозга.
4. Удалите мышь из стереотаксической рамы и закройте рану автоклипом.
5. Поместите мышь на согревающий коврик для поддержания температуры тела и непрерывно контролировать дыхание и цвет слизистых оболочек и открытых тканей (подошвы ног).
6. Поместите мышь в стерильную клетку микроизолатора, как только она полностью оправиться от анестезии (стернальной и амбулаторной), и вернуть его в животное жилье объекта.

5. Постимплантация ухода за животными и наблюдения за животными

Примечание: Наиболее надежным признаком опухолевого притяжения и инфильтративного роста является постепенная, устойчивая потеря веса, сопровождаемая развитием сгорблевший осанки и грубой шерсти волос. В редких случаях, неврологические дефициты отмечаются, которые включают атаксия, парез, и судороги. Ортопедические первичные ксенотранспланты являются высокоинвазивными и развиваются в течение длительного периода времени. Мыши обычно проявляют симптомы роста опухоли через 3-6 месяцев после трансплантации.

1. Наблюдайте за мышами с ортопедическими ксенотрансплантами ежедневно для приема пищи и воды, поведения, ухода и признаков инфекции в месте разреза.
2. Администрирование кетопрофена (5 мг/кг подкожно, 1-2x в день), если боль или дистресс наблюдаются послеоперационно.
3. Удалить автоклипс через 8-10 дней после операции.
4. Взвешивание мышей еженедельно.
5. Мониторинг признаков и симптомов опухолевого прихвасы.

6. Сбор опухолей

Примечание: По этому методу первый корональный #1 (см. врез) содержит задний аспект обонятельных луковиц и передний аспект лобных долей. Присытытая опухоль наиболее распространенным в правом полушарии последующих 3 корональных ломтиков (ломтик #2, #3 и #4) и инъекции зрение обычно содержится в корональной ломтик #3. В зависимости от экспериментальных потребностей, материал может быть использован для прохождения опухоли, замороженных секций тканей, формалин фиксированных парафин встроенных секций тканей, поток цитометрии диссоциированной ткани, клеточной культуры или лизолатов для анализа ДНК, РНК или белка. Части опухоли могут быть криоконсервированы для будущих потребностей с жизнеспособностью клеток, начиная от 80-95%.

1. Усыпляйте мышей длительным воздействием двуокиси углерода с последующим вывихом шейки матки.
2. Обезглавить усыпанных мышей в основании мозга (уровень foramen magnum) с большими ножницами хирургии, и вытащить кожу из разреза вперед, чтобы полностью разоблачить череп.
3. Удалите мозг.
   1. Вставьте один кончик пары тонких хирургических ножниц в боковой аспект foramen magnum до уровня левого внешнего слухового мяса, чтобы сократить затылчной кости вдоль левой стороны черепа. Выполните тот же разрез на правой стороне.
   2. Вырезать затылочной кости вдоль корональной плоскости от одного внешнего слухового мяса к другому и удалить кости подвергать мозжечок.
   3. Вырезать носовые костные пластины между глазами.
   4. Вырезать sagittal шва путем резки задней вдоль sagittal шва от носовых костных пластин к брегме. Завершите разрез средней линии вдоль сагиттального шва, разрезая переднюю от лямбды до брегмы.
   5. Тщательно вставьте кончик тонкой пары типсов вдоль сагиттального отверстия с каждой стороны, чтобы разорвать любые дурные адгезии черепа в мозг, а затем очистить две половины черепа боковой подвергать мозга и обонятельные луковицы спинно.
   6. Сдвиньте типсы между желудочковым аспектом обонятельных луковиц и черепа, чтобы освободить любые спайки.
   7. Наклоните череп назад, чтобы мозг был убран так, чтобы зрительные и другие черепные нервы подвергались воздействию. Разорвать черепные нервы, чтобы освободить мозг в блюдо, содержащее стерильные PBS.
4. Перенесите мозг с помощью шпателя для взвешивания на матричный срез и генерируем 2-мм корональных ломтиков с лезвиями бритвы.
5. Упорядочить корональных ломтиков в блюдо, содержащее стерильные PBS для дальнейшего визуального осмотра и дальнейшей обработки тканей.

7. Криоконсервация опухолей

1. Подготовье запасного раствора криоконсервации среды.
   1. Добавьте 50 мл добавки пролиферации, 5 мл 100x пенициллина и раствора стрептомицина, и 450 мкл 0,2% гепарина до 450 мл базальной среды.
   2. Храните решение для запасов при 4 градусах Цельсия, защищенном от света.
2. Подготовь рабочее решение криоконсервации среды.
   1. Смешайте 47,5 мл криоконсервации среднего и 2,5 мл стерильной ДМСО в 50 мл полипропиленовой конической трубки и хорошо перемешайте.
   2. Aliquot 1,0 мл рабочего раствора для каждого криовиального и хранить при 4 градусов по Цельсию защищены от света.
3. Поместите один 2 мм коронный кусочек ксенотрансплантированных мозга в криовиальный, содержащий криоконсервации среды на льду.
4. Плотно крышка флакона и поместите его в замораживающий контейнер при -80 градусов по Цельсию. Перенесите криовиальный на следующий день в резервуар с жидким азотом для более длительного хранения.

Результаты

Диссоциированные клетки глиомы пересаживаются непосредственно в мозг ослабленных иммунитетом мышей для получения первичных ортопедических линий ксенотрансплантата. Каждому образцу опухоли присваивается рандомизированное число до трансплантации, как часть процесса деидентификац?...

Обсуждение

Культурные клеточные линии, ксенотранспланты и генетически модифицированные мыши являются наиболее распространенными методами моделирования глиом, и существуют различные преимущества и ограничения для каждой^{модели системы 3,13,14}. Соответствующие преимущества первичной глиомы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501