Одно-растений, Стерильные Микрокосмы для нодуляции и рост бобовых растений<em&gt; Люцерна truncatula</em&gt; С ризобиальных симбионта<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Резюме

Рост Medicago truncatula растений в симбиозе с азотфиксаторов Sinorhizobium meliloti в отдельных стерильных микрокосм, изготовленной из стандартных лабораторных пластин позволяет частое обследование корневых систем и узелков без ущерба стерильности. Растения могут быть сохранены в этих камерах роста до 9 недель.

Аннотация

Ризобиальных бактерии образуют симбиотические, азотфиксирующих клубеньков на корнях совместимых хост-бобовых растений. Одним из наиболее хорошо развитых модельных систем для изучения этих взаимодействий является завод Люцерна truncatula резюме. Jemalong A17 и ризобиального бактерия Sinorhizobium meliloti 1021. Повторное изображений корней растений и забил симбиотических фенотипов требуется методы, которые неразрушающего либо к растений или бактерий. Симбиотические фенотипы некоторых основных бактериальных мутантов становятся очевидными после относительно коротких периодов роста, и не требуют долгосрочное наблюдение взаимодействия хост / симбионтов. Тем не менее, тонкие различия в симбиотических эффективности и узелок старением фенотипы, которые не видны на ранних стадиях процесса нодуляции требуют относительно длительные периоды роста, прежде чем они могут быть забил. Некоторые методы были разработаны для долгосрочного роста и наблюдения этого хоста / симбионтов пары.Тем не менее, многие из этих методов требуют неоднократного полив, что увеличивает возможность заражения другими микробами. Другие методы требуют относительно большого пространства для роста большого числа растений. Метод, описанный здесь, симбиотические рост M. truncatula / С. meliloti в стерильных, одного завода микрокосм, имеет ряд преимуществ. Растения в этих микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для того, чтобы полив не требуется на срок до 9 недель, предотвращая перекрестного загрязнения во время полива. Это позволяет фенотипы быть количественно, которые могут быть пропущены в системах роста краткосрочных, таких как тонкие задержки в развитии конкреций и в начале конкреций старения. Кроме того, корни и узелки в микромире легко просматривать через крышку пластины, поэтому до-укоренения растений для наблюдения не требуется.

Введение

Взаимодействие между бобовых растений-хозяев Medicago truncatula A17 и ризобиальных бактерии Sinorhizobium meliloti 1021 является одним из самых сговорчивых модельных систем для изучения развития узелков корневой и азотфиксирующего симбиоза. Геномы обоих симбиотических партнеров были последовательными ^1,2 и оба завода и бактерии поддаются генетической манипуляции ^3,4. Анализ фенотипов как основных бактериальных мутантов требуется способность наблюдать этапы развития узелков и количественно симбиотические производительность с течением времени. Здесь мы опишем метод для наблюдения развития клубеньковых М. truncatula резюме. Jemalong A17 инокулированные S. meliloti 1021 в рамках отдельных микрокосм, изготовленных из стандарта, круглый диаметром 100 мм, 15 мм в глубину лабораторных пластин (рис. 1А). Съемки подвергается и растет через зубчатым портала в стороне пластины (FigurES 1B, 1C и 1E). Корни содержатся в микрокосмах и выдерживают стерильный, позволяя при наблюдении через крышку пластины (фиг. 1D). Поскольку съемки доступен, его рост не ограничен и может быть измерена с периодическими интервалами без ущерба стерильность корня. Метод создания зубчатый пластинчатые микрокосм была первоначально разработана Ли и др.. ⁵ для выращивания растений люцерны, но она не была широко принята, несмотря на его многочисленные преимущества по сравнению с другими методами. Разновидностью этого метода была также разработана для анализа взаимодействия между корнями растений и микоризы ^6. Мы теперь адаптирована и оптимизирована этот метод для роста M. truncatula растения. Преимущества этого протокола более наиболее часто используемых методов описаны ниже.

Есть несколько методов, которые в настоящее время в широком использовании для нодуляции исследований М. truncatula inoculated с S. meliloti ^7. Наиболее часто используемый способ получения масштабной желвачный корней рост аэропонного кессонов ^7. В этом способе растения подвешены на большой емкости и корни газированные смесью S. meliloti и питательный раствор ^7. Этот способ является практичным, если только один генотип С. meliloti для которого требуется проверить. Так как это требует аэрозолизации высоких концентраций бактерий, существует высокая вероятность перекрестного загрязнения между кессонов, привитых различных бактериальных штаммов. Другой метод, который часто используется для подготовки большого количества привитых растений является рост в кадках или горшках перлит, вермикулит, песок или кальцинированной глины, которые переплетаются с питательным раствором и инокулированного S. meliloti ^7. Этот метод требует использования открытых ваннах или горшках, и требует полива и пополнение питательного раствора. Другим недостатком является то, что горшках растениядолжны быть удалены из этой матрицы макрочастиц для изучения корней и узелков. Другой недостаток этого метода в том, что большая площадь инкубатора пространства требуется при многих различных С. meliloti генотипы должны быть сравнены, потому отдельный горшок должен быть использован для каждого бактериального генотипа. "Леонард банку" является вариацией на этом методе ^8,9. Леонард сосуд состоит из двух стерилизованных сосудах уложенных один поверх другого и соединенных фитиль. Среда роста помещается в нижней емкости и втягивается через фитиль под действием капиллярных сил в матрицу роста перлит, вермикулит, песок или прокаленной глины в верхней судна. Рассада (ы) размещаются в матрице роста и инокулировали S. meliloti. Этот метод не требует полива, но исследование корней и узелков требует, чтобы саженец быть удалены из матрицы роста частиц.

Есть несколько методов, которые позволяют легко экспертизу кенгуруц. Одним из них является прозрачным "мешочек рост" пластик ^7. Недостатком этого метода является то, что частый полив требуется, так как только ≤ 10 мл жидкой среды является оптимальным для выращивания М. truncatula в мешочках ^7. Чехол эксперименты также обычно ограничивается ~ 2 недели ^7, в связи с распадом бумаги фитиль в сумке. Два других методов, которые обычно используются похожи на нашего метода в том, что растения, выращенные на агаре и корни видны, но эти способы также имеют недостатки, что наша процедура позволяет избежать. В этих способах растения полностью содержится в пределах 24,5 см х 24,5 см чашках с агаром запечатанных вокруг верхней части с пористой или хирургической лентой, выращенные в агар-уклон труб закрывали пробками хлопка или пластмассовыми крышками ^7. Оба этих метода позволяют легко Анализ корней и может быть стерильными. Тем не менее, скошенного агара трубки обычно выращивают только с 20 мл агаровой среде ⁷ и требуют полива и питательных веществddition для долгосрочного роста растений. Растения, выращенные в пределах 24,5 см х 24,5 см агаром микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для долгосрочного роста, но растет стрелять быстро становится скованным в закрытых пластина микрокосм и газообразный этилен может создать ингибирования нодуляции ^7. В процедуре, описанной здесь, стрелять подвергается и растет свободно вне микромира, которая содержит ~ 70 мл средства массовой информации, что позволяет долгосрочного роста.

Процедура, описанная здесь может быть полезен не только для изучения клубеньков бобовых растений, но и для изучения корневых фенотипов других среднего размера растений. Разница между этими микрокосмах и традиционный поликарбонат растительной ткани-культуры в том, что банку корни в пластине микрокосмах описанных здесь расти на вертикальной поверхности агара, а не вниз в горизонтальном слое агара в нижней части банки. Это позволяет корневой быть отходит от поверхности агара с минимальной DAmage для корневых волосков и минимальной адгезией агара к поверхности корня, что облегчает изучение корневых волосков с помощью микроскопа.

протокол

Выполнение шагов 1, 2, 4 и 6 в стерильном ламинарном боксе рекомендуется.

1. Подготовка М. truncatula A17 Рассада

Примечание: М. truncatula A17 семена, используемые в этих исследованиях производятся под охлажденных тепличных условиях при температуре ~ 22 ° C, или в комнате роста растений, поддерживаемой при 22-26 ° С с ~ 150-400 ммоль / м ^{-2 с -1} света.

1. Налейте прорастания семян пластин: Используйте 100 мм квадратных пластин (15 мм в глубину) и залить автоклавного 1.1-1.2% вес / объем очищенного агара ¹⁰ на глубину 3-5 мм. Каждая пластина будет использоваться, чтобы прорасти ~ 0,25-0,5 г семян (эквивалент 63-125 семян / пластины).
   Примечание: Очень важно использовать культуре клеток растений проверенные, очищенный агар для всех пластин, описанных в этом протоколе. Поставщик и номер по каталогу информация для агара указана в Таблице специфических реагентов и оборудования.
2. Разрыхлить / стерилизовать М. truncatula A17 семянс: Взвесьте достаточные семена нужного количества саженцев. (M. truncatula A17 семена ~ 4 мг каждого) Место семена в стерильных 125 мл колбах со стерильным крышками из фольги (0,25-0,5 г семян / колбу, это ~ 63-125 семена) и пипетка 20 мл концентрированной (96%) H ₂ SO ₄ вдоль боковых сторон колбы.
   Примечание: кислота скарификация будет стерилизовать семена. Кроме того, с помощью пипетки кислоты вдоль сторон колбы, он будет повторно стерилизовать внутри колбы, которая вступает в контакт с нестерильных семян.
3. Разбейте комки семян со стерильным стеклянной пипетки. Вихревой каждую колбу часто на 10-12 мин. Небольшие, коричневые ямы станет видимым на семенах. Эти крошечные отверстия в семенной оболочки ^11.
   Примечание: Используйте защитные очки и перчатки при работе с концентрированной H ₂ SO _4.
4. Удалить H ₂ SO ₄ и промыть семена: Когда, по крайней мере 10% семян имеют небольшие коричневые ямы, или 12 мин прошли, в зависимости от тогона первом месте, удалить все кислоту из колб с стерильную стеклянную пипетку. (Место отходов кислоты в 1-2 л стакан, содержащий не менее 300 мл водопроводной воды. Это будет разбавить кислоту и предотвращения перегрева.) Наклоните колбу для сбора остатков кислоты в кривой колбу и использовать небольшую стеклянную пипетку к удалить все оставшиеся кислоту. Если остаточная кислота остается, она будет реагировать с промывочной воды, нагреть семена и убить их.
   1. Промойте семена, быстро заливки 100 мл стерильной воды высшей степени очистки в каждую колбу. Избыток объем воды будет разбавлять кислоты и предотвратить перегрев и повреждение семян в процессе реакции кислоты с водой. Слейте воду и пламя стерилизовать губу колбы.
   2. Промыть семена 8-10X с 50 мл стерильной сверхчистой воды. Вихревой колбу в течение каждого полоскания. Колбу следует рассматривать стерильный в этой точке и губа колбы должна быть запылано перед каждым полоскания.
5. Пусть семена впитывают ночлега: После того, какпоследнего полоскания, залить 50 мл стерильной воды высшей степени очистки в каждой колбе, замените стерильную фольгу на каждой колбы и место при 4 ° С в темноте в течение ночи.
6. Место семена на всхожесть пластины: После позволяя семена впитывают всю ночь, слейте воду, промойте 2x с ~ 25 мл воды высокой степени очистки, а затем добавить 20 мл стерильной сверхчистой водой, вихревые ресуспендировать семена и залить их на 1,1-1,2% агар прорастания пластины из шаг 1.1. Если семена остаются в колбе, добавьте больше воды и залить снова. Распределите семена из каждой колбы в одной тарелке (63-125 семена / пластины).
   1. Вихревой тарелку распространять семена. Семена должны быть равномерно распределены в диапазоне 4-5 см на одном конце пластины. Это будет "сверху" пластины. «Дно» 5-6 см должны быть свободны от семян (рис. 2А).
   2. Слить воду с стерильной пипеткой. Наклоните пластину под углом 45 °, чтобы в канализацию оставшиеся воды в нижней части пластины. Замените крышку на ТильТед пластины и защиты от света. Плиты должны иметь возможность слить 10-20 мин. (Фиг.2В).
7. Установка прорастание: Удалить все воду, которая собирается в нижней части наклонной пластины с стерильной пипетки.
   1. Закройте крышку и уплотнение тарелку парафильмом. Надевайте перчатки и стерильная чистота (рис. 2С).
   2. Стек прорастания пластины, а затем повернуть все из них до под углом 90 °. Семена будет лежать на вертикальной поверхности агара. Полностью впитал семена должны легко придерживаться агара. Корни будут расти вниз (рис. 2, г).
   3. Оберните пачку прорастания пластин в фольге, чтобы блокировать свет и держать при температуре 25 ° С в течение 3 дней.

Примечание: Если прорастание выручка за менее чем 3-х дней, корни могут быть слишком коротким, чтобы достичь агара в микрокосм. Если всхожесть продолжается более 4 дней до перевода в микромира пластин, выживание рассады будетбыть бедным. Если М. truncatula экотипы или мутанты с более медленными темпами прорастания должны быть сравнены, медленно-прорастающих экотип должно быть позволено, чтобы прорасти срок более 3 дней.

2. Подготовка индивидуальных микрокосм Plate

1. Подготовка среды ¹² (см. Таблицу 1 для композиции), позволяющий ~ 70 мл среды Дженсена для каждого микрокосма. Подготовка в кувшины или колб, которые удобны для быстрого розлива (не более 1-2 л на кувшин) и оставить магнитной мешалкой в ​​кувшин во время обработки в автоклаве.
   1. После средней остынет до ~ 55-65 ° C, добавки были добавлены, и рН был проверен (см. таблицу 1), разлить в круглом диаметром 100 мм, 15 мм в глубину пластины. Плиты следует вылить ~ 0,9-1 см в глубину (~ 70 мл / планшет).
   2. Компоненты среды Дженсена могут образовывать мутного осадка, поэтому важно, чтобы вернуть кувшин с магнитной мешалки периодически, чтобы предотвратить компоненты из осаждение. Осадки могут быть по отношениюible в пластине после того как они затвердевают и не влияет на производительность тех пор, пока они равномерно распределены среди пластинок.
   3. Стек пластин во время заливки, чтобы предотвратить образование конденсата на пластинчатых крышками.
2. После пластины Дженсена укрепили, засечь обе пластины и крышки с весом шпателем, который был согнут в U-образной ⁵ (рис. 3А). Нагрейте изгиб шпателем с горелкой до докрасна, первоклассных 5-6 пластин, а затем нагреть снова. Когда зубчатый крышка находится на зубчатым пластины, это создаст овальную портал, через который стрелять из рассады будет расти (рис. 3б). Если зубчатый пластины должны храниться, оберните индивидуально с парафиновой пленки ..

3. Подготовка Sinorhizobium meliloti культур

За два дня до растений прививок, начать культур всех S. meliloti напрягается, чтобы быть внесено на рассаду. Cultuразрешение должны быть выращены в LBMC (Лурия-Бертани [Миллер]) среднего ¹³ дополнена 2,5 мМ MgSO _4, 2,5 мМ CaCl _2, и соответствующими антибиотиками (TY среда также хорошо работает). Как ни мало 2-3 мл каждой культуры будет достаточно.

1. Расти при 30 ° С при встряхивании в течение 2 дней, пока клетки не плотны.
2. Для большинства растений прививок, фаза роста S. meliloti не является критическим. Как правило, в конце войти или ранней стационарной фазы клетки используются.

4. Разметка М. truncatula Рассада на отдельных микрокосмы

1. После 3 дней, открыть прорастания пластину (полученного на стадии 1), и сразу же залить стерильной сверхчистой воды. Dip щипцы в этаноле и пламени кратко стерилизации. Используйте стерильного пинцета аккуратно введите кончики корней всех саженцев под водой, чтобы предотвратить высыхание. Корни будет колебаться от 2-6 см в длину. Большинство будет 3-4 см. Выберите саженцы с прямыми корнями и не очевиднодефекты.
2. Проверьте крышек средних микрокосм в Дженсена для наращивания конденсации. Флик крышку, чтобы удалить конденсат или заменить его на новый зубчатый крышкой. Если есть избыток конденсата на крышке, корень рассады может присоединиться к крышке, а затем умирают после конденсации высыхает.
3. Используя щипцы, осторожно выбрать саженец от прорастания пластины семядолей и заложить корень на средней микромира Дженсена. Убедитесь, кончика корня находится в контакте с агаром.
4. Аккуратно удалите семенную оболочку, если она по-прежнему присутствует. Семенной пальто должна быть свободной после вымачивания в воде в течение 5-10 мин. Аккуратно дразнить семенной оболочки с пинцетом, пока он не уступает, и выбросьте. Семядоли и около 0,5 см съемки должны выступать из U-паз в пластине (рис. 4А). Осторожно установите крышку пластины с U-вырезом крышки над рассады, создание портала для рассады (рис. 4В).Установите пластины в сторону в горизонтальной стеков, пока все саженцы не были размещены на микрокосм.
5. Используйте все саженцы из каждого прорастания пластины, которые выглядят жизнеспособными и иметь прямой корень. (Если возможно, оставьте одну тарелку рассады не открываются для использования в качестве замены для увядших саженцев непосредственно перед прививкой.)
6. После возложения все саженцы, чтобы они могли сидеть на микрокосм по горизонтальной Дженсена в то время как С. Готовятся meliloti суспензии посевной.

5. Подготовка S. meliloti посевного материала Суспензии

1. Проверьте S. meliloti культуры периодически после прививки, чтобы быть уверенным, что они растут. После роста 2 дня, ОП ₆₀₀ должно быть между 2 и 4.
2. Пипетка 0,5 мл каждой культуры в стерильный 1,5 мл пробирку и центрифугируют для осаждения. Удалить супернатант.
3. Вымойте клеток два раза в любом 0,85% стерильного NaCl или стерильной воды высшей степени очистки. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл 0,85% стераздражать NaCl или сверхчистой воды.
4. Измерьте OD ₆₀₀ 1/10 разведения ресуспендированного S. В meliloti культур, начиная с шага 5.3. Исходя из этого чтения, сделать суспензию каждой культуры в стерильной сверхчистой воды на OD ₆₀₀ = 0,05. Если плотность клеток является слишком высокой, клубеньков может быть подавлено. Сделать достаточное количество разбавленной суспензии так, чтобы 100 мкл может быть внесено на каждый саженец. Помутнение OD ₆₀₀ = 0,05 приостановлении должно быть только едва заметно на глаз.

6. Прививка и Герметизация микрокосмы

1. Непосредственно перед начинающим прививок, проверьте увядших саженцев, которые не пережили переход на средних микрокосм в Дженсена. Замените эти саженцы со свежими рассады от всходов пластин.
2. Откройте каждый микрокосм и привить 100 мкл соответствующей S. meliloti подвеску на корню рассады. Закройте крышку и отложите в горизонтальном НТККкс 6-10 микрокосм. Для каждого S. meliloti штамм для сравнения, привить не менее 15 растений. Для штаммов, которые имеют тонкие различия в симбиотической производительности, привить 30-35 растений. Оставьте как минимум 10 заводов неинокулированную в качестве отрицательного контроля. Привить 30-35 растений с S. meliloti 1021 или другой соответствующий штамм дикого типа в качестве положительного контроля.
3. После того, как С. meliloti подвеска успел адсорбировать на поверхности корня и суспензию жидкость всасывается в агар (по крайней мере 20 мин.), оберните каждую тарелку индивидуально с парафиновой пленки. Плиты должны быть обернуты до самого края выреза, но парафин фильм не должен блокировать рост рассады (рис. 4С).
4. Во время упаковки, сделать окончательную проверку для корней, прилипших к внутренней стороне крышки пластины. Для удаления прилипших корни от крышки, заложить пластину плашмя на скамейке и нажмите или Флик крышку выбить корень обратно на агар суrface.
5. Выстроить рассада порталы каждого стека 6-10 пластин. Положите стопку под углом 90 ° с сеянцы направлена ​​вверх (рис. 4D). Клейкость парафиновой пленки проведет пластин в месте достаточно долго, чтобы обернуть весь стек в фольгу, оставляя 1-2 см полосу развернул где сеянцы появляются (рис. 4E). Фольга защитит корни от света.
6. Поместите фольги завернутые стеки в освещенной камере роста или комнату роста на 21-25 ° С, 60-70% относительной влажности и 100-175 мкмоль / м ^-2 с ^-1 света на 16 ч света / 8 ч темноты ( На фиг.1А). В этих условиях роста, длительной инкубации при освещенности выше, чем 200 мкмоль / м ^-2 с ^-1 может иметь отрицательное влияние на рост растений.

7. Экспертиза систем корней и количественного симбиотических фенотипов

Растения могут быть сохранены вмикрокосмы на срок до 9 недель.

1. Число Узелок может быть определена количественно в серии временных точках по разворачивания фольгу от каждого стека и подсчета узелки. Разработка узелки на заводах инокулированные S. meliloti 1021 дикого типа являются очевидными 10-14 дней после посева.
2. Симбиотическая производительности также может быть измерена в каждый момент времени, измеряя длину формирующейся стрелять.
3. Окончательный количественный анализ симбиотической производительности обычно выполняется в 7 недель после прививки, отсоединив стрелять и измерения сырой вес побега. Этот шаг может быть выполнен как в конце 9 недель, если больше рост желательно.

Результаты

Подготовка и посев этих плит микрокосмах относительно прост по сравнению с большинством других способов, описанных во введении. Использование этих микрокосмах также позволяет длительное роста растений (до 9 недель) без полива или питательных добавок, содержание корневой стерильности...

Обсуждение

Есть несколько шагов, протокола, которые имеют решающее для успеха: 1) Необходимость использования очищенной, завод клеточной культуры проходят агар не может быть переоценена. Это не является критическим для проростков люцерны, но это имеет решающее значение для роста M. truncatula A17. 2) ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921