На месте TEM биологических ассамблей в жидкости

Резюме

Здесь мы описываем процедуру изображения вирусных комплексов в жидкости при разрешении нанометров с помощью электронного микроскопа передачи.

Аннотация

Исследователи регулярно используют радиоэлектронные микроскопы (ТЭМ) для изучения биологических сущностей и оценки новых материалов. Здесь мы описываем дополнительное приложение для этих инструментов - просмотр вирусных сборок в жидкой среде. Этот захватывающий и новый метод визуализации биологических структур использует недавно разработанный микрофлюидный держатель образца. Наша видео статья демонстрирует, как собрать и использовать микрофлюидный держатель для изображения жидких образцов в TEM. В частности, в качестве нашей модельной системы мы используем симианские ротавирусные двухслойные частицы (DLPs). Мы также описываем шаги, чтобы покрыть поверхность жидкой камеры с сродством биопленок, которые привязывают DLPs к окну просмотра. Это позволяет нам изображения сборки таким образом, что подходит для определения 3D-структуры. Таким образом, мы представляем первый взгляд на подвирусные частицы в родной жидкой среде.

Введение

Общей целью биологов и инженеров является понимание внутренней работы молекулярных машин. Передача Электронные микроскопы (ТЭМ) являются идеальными инструментами для визуализации этих сложных деталей при почти атомном^{разрешении 1-2}. Для того, чтобы поддерживать высокую вакуумную систему TEM, биологические образцы, как правило, встроенные в тонкие пленки стекловидного^{льда 3,сахара 4}, соли^{тяжелых металлов 5}, или некоторые комбинации^{из них 6}. В результате изображения встроенных образцов могут выявить лишь ограниченные снимки динамических процессов.

Ранние попытки сохранить биологические образцы гидратированных в экологических жидких камерах были предприняты Парсонс и его коллеги с использованием дифференциальных этапов перекачки. Электронные дифракционные узоры неоближенных кристаллов каталазы были успешно записаны с разрешением 3 евро в гидратированном^{состоянии 7-8.} Кроме того, фазополученные липидные области могут быть исследованы в гидратированных мембранах^{эритроцитов человека 9-10.} Однако движение, вызванное распространением жидкости и ее вмешательством в электронный луч, привело к серьезной потере разрешения, и дальнейшие эксперименты с использованием биологических образцов не были предприняты до недавнего времени.

Недавно были введены недавно разработанные держатели микрофлюидных образцов, которые используют полупроводниковые микрочипы для формирования микро-масштабной экологической камеры. Эти устройства могут поддерживать образцы в жидкости, пока они расположены в столбце^{TEM 11-12.} Этот технический прорыв в визуализации TEM позволил исследователям впервые просмотреть прогрессивные события на молекулярном уровне^13. Мы называем эту новую модальность«молекулярной микроскопией на месте», так как эксперименты теперь могут проводиться «внутри» столбца^14-15. Общая цель этого метода заключается в изображении биологических сборок в жидкости для того, чтобы наблюдать их динамическое поведение при разрешении нанометра. Смысл разработанной методики заключается в том, чтобы записывать наблюдения в режиме реального времени и изучать новые свойства биологического механизма в растворе. Эта методология расширяет использование ТЭМ для более широких целей в клеточной и молекулярной^{биологии 12-16.}

В текущей видео-статье мы представляем всеобъемлющий протокол для сборки и использования коммерчески доступного держателя микрофлюидных образцов. Эти специализированные держатели используют микрочипы кремния нитрида, произведенные с интегрированными проме сторонами, чтобы сформировать жидкую камеру, которая заключает мельчайшие объемы раствора. Тонкие прозрачные окна выгравированы в микрочипах для целей визуализации^12. Мы демонстрируем правильное использование микрофлюидного держателя для изучения симиановых ротавирусных двухслойных частиц (DLPs) в жидкости с помощью TEM. Для обеспечения того, чтобы биологические сборки, такие как DLPs, не быстро рассеиваются на большие расстояния во время визуализации, мы используем подход Affinity Capture, чтобы привязать их к поверхности микрофлюидной^{камеры 16.} Этот молекулярный шаг захвата имеет большое преимущество перед альтернативными методами для визуализации биологических образцов в жидкости, поскольку он позволяет приобретение изображений, которые будут использоваться для обработки вниз по течению процедур. Этот шаг захвата, используемый в сочетании с микрофлюидной визуализацией, уникален для наших^{процедур 17.} Читатели, использующие структурные биологические приложения с использованием TEM или микрофлюидных камер визуализации, могут рассмотреть вопрос об использовании методов сродства захвата, когда динамические наблюдения на молекулярном уровне являются конечной целью.

протокол

1. Подготовка Affinity Захват устройства¹⁶

1. Очистите кремниевые нитридные E-чипы, инкубируя их в 15 мл ацетона в течение 2 мин, а затем 15 мл метанола в течение 2 мин (Рисунок 1A). Разрешить чипы высохнуть под ламинарным потоком воздуха.
2. Инкубировать сушеные чипсы на нагретой тарелке перемешать (без перемешивания) в течение 1,5 часа при температуре 150 градусов по Цельсию, а затем дать им остыть до комнатной температуры перед использованием.
3. Используйте шприцы Гамильтона для составления липидных смесей в маленьких стеклянных трубках, чтобы содержать 25% хлороформа, 55% DLPC (1,2-дилауроил-фосфохолин) в хлороформе (1 мг/мл) и 20% липид ni-NTA (1,2-диолеоил-иминодиадиатический кислотно-сукцинил-никелевая соль) в хлороформе (1 мг/мл) при общем объеме 40 л.
4. Нанесите 1 зл алицит смеси на каждую каплю воды Милли-З на кусок Парафильма во влажной чашке Петри(рисунок 1B). Инкубация образцов на льду не менее 60 мин.

2. Захват макромолекул¹⁷

1. Поместите E-чип с интегрированным спейсером 150 нм поверх образца монослой и инкубировать в течение 1 мин(рисунок 1С).
2. Аккуратно свяжите чип с образца и добавьте 3 йл алицита его помеченного белка A. Incubate в течение 1 мин при комнатной температуре(рисунок 1D).
3. Пятно от избыточного падения с помощью Whatman #1 фильтровальной бумаги и сразу же добавить 3 йл aliquot раствора антител. Инкубация в течение 1 мин при комнатной температуре.
4. Удалите избыток раствора с помощью шприца Гамильтона и немедленно добавьте 1 йл алицит ротавирусных DLPs (0,1 мг/мл) в буферный раствор, содержащий 50 мМ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ и 10 mM CaCl₂. Инкубация в течение не менее 2 минут при комнатной температуре. Подготовка DLPs была описана ранее¹⁸.

3. Соберите микрофлюидную камеру и загрузите держателя образца in situ

1. Загрузите мокрый E-чип, содержащий вирусный образец, в кончик держателя микрофлюидного образца. Свечение разряда второй плоский E-чип в течение 1 мин, а затем загружены на верхней части чипаспейсера (рисунок 2, панели 1-5).
2. Кроме того, для увеличения контрастности биологических макромолекул, тяжелых металлических пятен (например,0,2% уранал-мэта) можно добавить к влажным образцам до размещения второго E-чипа на мокром образце. Тем не менее, E-чип, содержащий образец, должен быть промыт водой Милли-З до добавления контрастного реагента.
3. Сэндвич всю сборку вместе, чтобы сформировать запечатанный корпус, удерживаемый на месте механически в держатель на 3 латунныхвинта (рисунок 2, панели 6-8).
4. После сборки кончик держателя перекачивается до 10^-6 Torr с помощью турбо-накачиваемой сухой насосной станции перед размещением держателя внутри TEM.

4. Изображение в жидкости с помощью электронного микроскопа передачи

1. Загрузите держатель образца in situ в электронный микроскоп передачи (компания FEI), оснащенный нитью LaB₆ и работающий на 120 кВ.
2. Включите нить TEM и отрегулируйте эвцентрическую высоту стадии микроскопа по отношению к образцу, используя функцию воблера, чтобы наклонить образец от -15 до 15 градусов взад и вперед в столбце. Эта процедура регулирует этап в z-направлении, чтобы помочь объяснить правильную толщину жидкой камеры. Этот шаг также обеспечивает точное увеличение используется при записи изображений.
3. Запись изображений по краям и в угловых областях микрофлюидной камеры в первую очередь. Эти области обычно содержат тончайшее решение. Запись изображений образцов в условиях низких доз (1-3 электрона /^{No 2}) с помощью камеры CCD. Используйте номинальные увеличения 6000X - 30,000X.
4. Определите правильное значение дефокуса, сосредоточив внимание на краю жидкой камеры. Используйте значение -1,5 мкм для записи изображений при увеличении на 30 000X. Если при подготовке образца не используется толстый раствор или если контрастный агент не используется, используйте более высокие значения дефокуса в диапазоне от -2 до -4 мкм.
5. Чтобы обеспечить раствор, содержащийся в микрофлюидной камере на протяжении всех экспериментов, сосредоточьте электронный луч до тех пор, пока пузырьки не образуются в жидкости внутри устройства.

Результаты

Репрезентативные изображения DLPs в жидкости с использованием E-чипов, которые были светятся разрядки (Рисунок 3A) показывают меньше DLPs в данной области просмотра, предположительно из-за диффузии, по сравнению с DLPs, которые обогащены на устройствах Affinity Capture (Рисунок 3B). Д?...

Обсуждение

В нашей представленной работе мы использовали подход к захвату сродства, чтобы привязать ротавирусные DLPs к микрофлюидной платформе. Это позволило на месте изъястить макромолекулярные комплексы в жидкой микрооквидеоронии. Подход к захвату имеет важное значение по отношению к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr