JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Lipoxygenase (LOX) изозимы могут генерировать продукты, которые могут увеличить или уменьшить нейровоспламенение и нейродегенерации. Исследование взаимодействия генно-экологической среды может выявить эффекты, связанные с LOX isozyme. Использование 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) модель нигостриатального повреждения в двух ЛОКС изозим-дефицит трансгенных линий позволяет сравнить вклад ЛОКС изозимов на дофаминергической целостности и воспаления.

Аннотация

Lipoxygenase (LOX) деятельность была вовлечена в нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, но его последствия в болезни Паркинсона (PD) патогенеза менее понятны. Модели взаимодействия генной среды имеют полезность в разоблачении воздействия конкретных клеточных путей на токсичность, которое не может наблюдаться только с помощью модели генетических или токсических заболеваний. Для оценки, если различные LOX isozymes выборочно способствовать PD связанных нейродегенерации, трансгенных(т.е. 5-LOX и 12/15-LOX дефицит) мышей могут быть оспорены с токсином, который имитирует травмы клеток и смерти в беспорядке. Здесь мы описываем использование нейротоксина, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), который производит нигростриятическое поражение, чтобы прояснить различные вклады LOX изозимы в нейродегенерации, связанные с PD. Использование MPTP в мыши, и нечеловеческих приматов, хорошо создана для повторения нигростриятального повреждения в PD. Степень MPTP-индуцированного поражения измеряется анализом HPLC допамина и его метаболитов и полуколичествительным западным анализом помарки стриатума для гидроксилазы тирозина (TH), ограничивающего скорость фермента для синтеза допамина. Для оценки воспалительных маркеров, которые могут продемонстрировать LOX изозим селективной чувствительности, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и Иба-1 иммуногистохимии выполняются на участках мозга, содержащих substantia nigra, и GFAP Западный анализ помарки выполняется на триатальных гомогенатов. Этот экспериментальный подход может дать новое представление о генно-антеманых взаимодействиях, лежащих в основе нигростриатальной дегенерации и PD.

Введение

Использование моделей взаимодействия генно-экологической среды обеспечивает подход к имитации факторов риска, которые могут повлиять на идиопатической болезни Паркинсона (PD) и дает возможность различить механистические идеи, которые вряд ли будут выяснены с помощью генетической или токсикологическойсистемы только 1,2. Здесь мы иллюстрировать этот момент и описать применение 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) мыши модель нигростриатальнойдегенерации 3, чтобы лучше понять избирательность липоксигеназы (LOX) изозима деятельности на нейровоспламенениеи токсичность 4. Хотя роль LOX isozymes была широко оцененав периферических расстройств 5,6, а также болезни ЦНС, включаяинсульт 7 и болезнь Альцгеймера8,9, роль семьи изозимов в нигостриаальной функции и дегенерации, связанные с PD не очень хорошо понимается и требует изучения. MPTP нейротоксин демонстрирует преференцианую дегенерацию нигростриатального пути и recapitulates стриатального истощения допамина и нигральной дофаминергической потери клеток, которые лежат в основе двигательных нарушений у пациентов PD10. Хотя эта модель не воспроизводит полный кадр немоторных и моторных PD поведения и откровенный α-синуклеин-положительной патологии тела Леви, было полезно, чтобы прояснить новые механистические цели, которые способствуют nigrostriatal повреждения и на ранней стадии трансляционного тестирования, как это лучше всего характеризуется неинвазивной модели доступны для надежного производства нигриальной клеточной смерти сопровождается striatal допаминапотери 11-15. Широкое использование mpTP мыши, с парадигмами, начиная от острой, подостралидо хронической 16-18, позволило для стандартизации дозирования, чтобы привести к легкой до тяжелой нигостриатальнойповреждения 19,20 с активацией различных механизмов токсичности в зависимости отрежима лечения 18,21,22. Следовательно, это позволяет "окно поражения", которые будут направлены, что может привести к повышению или снижению нигростриатальной травмы в зависимости от терапевтического агента или трансгенноймодели, используемой 23-25.

Кроме того, важное значение для трансляционных и открытий биологических исследований являются методы, используемые для оценки ущерба и доказательств, таких методов. Для модели мыши MPTP, установленные метрики для оценки поражения являются измерение маркеров стриатального дофаминергического тона, в том числе допамина и его метаболитов HPLC, и западный анализ помарки тирозин гидроксилазы (TH), ограничивающий скорость фермент в синтезе допамина, ипоказатели дегенеративных событий, таких как глиальная активация с использованием анализа западных помарк и иммунофимистики 4. Хотя это классические нейрохимические, биохимические и гистологические процедуры, методы обеспечивают критические и воспроизводимые считывания о степени повреждения в нигостриатального дофаминергического пути, указывают механизмы токсичности, и оказались ценными инструментами в понимании дегенеративных событий в PD.

протокол

Примечание: Все процедуры и методы ухода за животными должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию животных (IACUC). Описанное здесь исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами, установленными МАКУК НИИ Интернэшнл.

1. Приобретение и техническое обслуживание мышей с дефицитом LOX

  1. Покупка 5-LOX-дефицит или 12/15-LOX-дефицит мышей и соответствующих штаммов и секс-соответствующих элементов управления в возрасте 7-8 недель и позволяют несколько дней для акклиматизации объекта после прибытия.
  2. Поддержание мышей в группе жилья на 12-ч светло-темный цикл и дать пищу и питьевую воду объявление libitum.

2. Меры предосторожности, хранения, подготовки, обеззараживания и удаления MPTP

Примечание: MPTP интоксикации от внутривенного воздействия у людей было показано, вызывают паркинсонизм10; MPTP является весьма липофильной и может легко пересечь гемово-мозговой барьер26. Следует принять меры предосторожности для обеспечения безопасного обращения, детоксикации и удаления. Его метаболизм включает в себя несколько шагов, включая преобразование в 1-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридиний фермента моноаминоксидазы B (MAO-B)27. Ингибиторы МАО-В могут быть использованы в случае случайной интоксикации человека.

  1. Убедитесь, что персонал имеет соответствующую подготовку по вопросам безопасности и обработки, прежде чем использовать MPTP в том, что продиктовано Комитетом по охране здоровья и безопасности учреждения. Каждое учреждение может установить и внедрить свои собственные стандартные оперативные процедуры для использования MPTP, на основе рекомендаций, всестороннеизложенных в литературе 17,22.
  2. Перед подготовкой, Дон соответствующее личное защитное оборудование (PPE), включая следующие: одноразовые лабораторные пальто или полный костюм тела, двойные перчатки nitrile, хирургическая маска, крышка для волос, защитные очки, и одноразовые бахилы. Правильный СИЗ следует носить во время подготовки MPTP, парадигмы инъекций и 72 ч после инъекции при обращении с животными и/или постельными принадлежностями.
  3. Выполняем расчеты перед подготовкой. Следует следовать институциональным руководящим принципам в отношении объемов досирования; доставка 100-150 мкл, как правило, используется для 25-30 г мышей.
    1. Для приготовления раствора 3 мг/мл MPTP в солевом растворе примените коэффициент коррекции (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP free base); концентрация MPTP-HCl в солевом транспортном средстве составляет 3,633 мг/мл.
    2. Подготовьте все оборудование, материалы и реагенты, необходимые для подготовки MPTP и потенциального обеззараживания разливов до обработки нейротоксина.
  4. Удалите флакон MPTP-HCl из надлежащего места хранения.
    Примечание: MPTP должен храниться на RT в закрытом флаконе в вторичном контейнере и храниться в закрытом шкафу с пометкой "MPTP".
    1. Обложка области окружающих весы с прокладками или бумажные полотенца смоченной с 10% отбеливатель раствор, чтобы уменьшить риск от пролитого порошка. Держите ткани и 10% отбеливатель раствор поблизости в качестве меры предосторожности.
    2. Используя аналитический баланс, расположенный в дымовом капюшоне, взвесьте 50 мг MPTP-HCl в стеклянный флакон со вторичным сдерживанием, содержащим 10% пропитанной отбеливателем ткани. Этикетка стеклянного флакона "MPTP" с концентрацией и датой.
    3. Закрыть флакон источника и протрите снаружи 10% отбеливателя.
  5. Медленно добавьте 13,763 мл стерильного солевого раствора во флакон и полностью закройте для смешивания. (Решение 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. В капюшоне тщательно стерилизовать mpTP раствор путем фильтрации с помощью фильтра 0,22 мкм в помеченный инъекционный флакон в вторичном контейнере с 10% пропитанной отбеливателем ткани. Очистите любой разлив с пропитанной отбеливателем ткани.
    2. Тщательно утилизировать острые и флаконы в надлежащим образом помечены биоопасных контейнера. Поддерживайте раствор MPTP во флаконе во вторичном контейнере с пропитанной отбеливателем тканью для транспортировки в процедурную комнату для животных.
      Примечание: не автоклав MPTP решение для стерилизации, как его испарение является ингаляционной опасности.
  6. Верните флакон MPTP в свой вторичный контейнер и поместите его в место хранения. Обеззараживание шпателем, аналитическим масштабом и поверхностью капота в течение 10 минут с использованием 10% отбеливателя.

3. Администрация MPTP

  1. Подготовка одноразовых клеток со стандартными микроизолатор перфорированными крышками, содержащими полиэфирные фильтрованные лайнеры с пометкой "MPTP" (минус проволочная пищевая решетка), одноразовые лайнеры клетки, предварительно влажные пищевые гранулы и гидрогель в качестве источника воды. Взвешивание всех животных и рекордный объем 3 мг/мл MPTP в солевой раствор, необходимый для инъекций 15 мг/кг.
    Примечание: метаболиты MPTP обнаруживаются в экскрементах в течение 3 дней послеинъекции 28,29; однако, мыши выделяют MPTP n-oxide, нетоксичную производную, которая не пересекает мембраны из-за своей гидрофилиности30.
    1. Ношение всех СИЗ, перечисленных выше, и проведение мышей над одноразовой абсорбции площадку, вводить солевой автомобиль или MPTP раствор для 15 мг/кг дозы в внутриперитонеальной полости (т.е.), ежедневно в течение 4 дней с одноразовым 26-го калибра туберкулина шприц.
    2. Не повторять шприц после использования; распоряжаться в специальный и помечены MPTP биоопасных острых контейнеров. Поддерживайте 10% отбеливателя и тканей поблизости, чтобы очистить любые случайные капли.
  2. Поместите животных, введенных с MPTP в одноразовых клетках, до 5 мышей на клетку, и дом на открытых стеллажах. Не используйте вентилируемые стеллажи.
    1. Поместите MPTP использовать плакаты на стойке, содержащей мышей и двери жилой комнаты до 72 ч после последней инъекции.
      Примечание: обеспечить температуру жилого помещения составляет от 22,2 до 24,4oC, как мыши испытывают преходящее переохлаждение до 12h после интоксикации MPTP. 31 год
    2. Обеззараживание рабочей поверхности отбеливателем после каждого использования (см. шаг 2.8), утилизация остатков раствора MPTP путем добавления объема, эквивалентного 10% отбеливателя, и отбрасывают содержимое в качестве биологических случайных жидких отходов.
    3. Откажитесь от всех используемых СИЗ в выделенной корзине для удаления. При необходимости распылите 10% отбеливателем перед удалением.
  3. Регулярно проверяйте животных и ежедневно обновляйте пищу и воду во время инъекций и 72 ч после последней инъекции. Примечание: хотя никакого загрязнения не ожидается в районе, непосредственно окружающем внешнюю часть клетки, этот регион рассматривается с раствором отбеливателя в качестве меры предосторожности (как описано в шаге 2.8). Следует позаботиться о всех мышах и оборудовании в этот период.
    1. Через три дня после последней инъекции, распоряжаться всеми клетками и лайнерами в надлежащим образом помечены биоопасной мешок. возобновить использование регулярного СИЗ и нормального жилья для животных; удалить дверные и полке плакаты.

4. Сбор тканей

  1. Euthanize животных путем вывиха шейки матки 7 дней после последней инъекции MPTP. Немедленно вскрыть мозг на льду с помощью предварительно охлажденной формы мозга с 1-мм слотами в корональной плоскости.
  2. Рассекаете стриатум из переднего ломтика толщиной 2 мм на уровне передней эмиссии.
    1. Удалите окружающие корковые и подкоркальные области с помощью скальпеля. Snap-заморозить стриатальной ткани из каждого полушария в отдельной 1,5-мл микроцентрифуг трубки для нейрохимического или биохимического анализа.
  3. Блок среднего мозга / заднего мозга в корональной плоскости на уровне передней гипоталамус и погружение-исправить ткани в 4% формальдегида аквеозный раствор.

5. Обработка тканей

  1. Процесс биохимии
    1. Гомогенизировать стриатальной ткани из одного полушария с помощью ультразвукового разрушителя клеток в 200-й й L Tris-EDTA лиза буфера (25mM Tris базы, 1mM EDTA, 1:100 протеазы и ингибитора фосфатазы коктейли) для 10 импульсов при 10-12 Гц и центрифугированы в течение 10 мин при 4oC при 1000xg.
    2. Тщательно аспирировать супернатант, и восстановить гранулы в 150-й лиза буфера. Фракции используются для биохимического анализа SDS-PAGE и западной blotting.
      Примечание: используйте протеазу и ингибитор фосфатазы, содержащий буфер в пределах 1 ч от подготовки из-за нестабильности в аквозных растворах.
  2. Процесс нейрохимии
    1. Используйте стриатум, рассеченный из другого полушария, из каждого образца, хранящегося при -80 градусов по Цельсию для HPLC. Оттепель стриатальных тканей в микрофуг труб на льду, добавить 500-й 0,3N перхлорной кислоты (PCA) и гомогенизировать с помощью sonicator.
      Примечание: Чтобы сделать 100 мл 0,3N PCA, мера 90-мл ddH2O, добавить в 100-мл градуированный цилиндр, добавить 2,58 мл 70% PCA, и довести до 100-мл знака. Этот буфер выборки может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
    2. Sonicate стриатальной ткани в 500-й йл ледяной 0,3N PCA, для 10 импульсов на 10-12 Гц и место на льду. Для обеспечения однородности, sonicate образцы во второй раз в течение 10 сек, затем центрифуга в течение 12 мин при 4oC при 16100xg.
    3. Немедленно декантировать супернатант до 1,5 мл микроцентрифуг трубки и хранить при -80 градусов по Цельсию. Воздух-сухой гранулы фракции в капюшоне.
    4. Поддерживайте супернатант при -80 градусов по Цельсию до использования для измерения допамина и его метаболитов, 3,4-дигидроксифенилацетической кислоты (DOPAC) и гомованильной кислоты (HVA) HPLC с электрохимическим обнаружением.
    5. После высыхания, восстановить гранулы фракции в 0,5N NaOH (500 йл), и кратко sonicate. Храните восстановленную фракцию гранул при 4 градусах Цельсия до использования для определения общего белка с использованием метода Лоури.
  3. Процесс иммуногистохимии
    1. Погружение-исправить среднего и заднего мозга блоков на ночь в 4% формальдегида aqueous раствор и криопротектор в градуированных растворов сахарозы (10% в фосфат-буферный солевой раствор (0,01 М. PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, и ddH2O, pH 7.4) для 24 h, после этого 30% в PBS до тех пор пока ткань не утонут) на 4'C. Кратко пятно криопротезированы блоки, чтобы удалить избыток раствора сахарозы, заморозить на сухом льду и хранить при -80 градусов до использования.
    2. Микротоме секции блоков мозга, содержащих среднего и заднего мозга в криостат.
      1. Удалите ткани из -80 градусов по Цельсию, эквилибрировать при -16 градусов по Цельсию на 1 ч в криостате и монтировать в тканях встраивающие средства массовой информации.
      2. Соберите корональных секций толщиной 40 мкм в криопротекторный раствор (0,01 МТ СТ СС с 30% сахарозой, 30% этиленгликоль, рН 7,4) при -16 градусов по Цельсию. Соберите ткани последовательно в 6 1,5-мл микроцентрифуг трубки с интервалом 240 мкм и хранить при -20 градусов по Цельсию.

6. Иммуноблоттинг

  1. Определите концентрацию белка в стриатальной супернатантной фракции (подготовленной, как описано в разделе 5.1) анализом BCA.
  2. Рассчитайте разбавление, необходимое для каждой выборки, чтобы дать 10 мкг на колодец, поставляемый в 20 мкл объема.
  3. Разбавить супернатантный белок буфером 4X Laemmli и буфером гомогенизации, чтобы дать 10 мкг белка в буфере 1X Laemmli. Пример расчета:
    1. Определите окончательную концентрацию белка и требуемый объем. В этом случае требуется 10 мкг в 20 мкл (0,5 мг/мл).
    2. Определите конечный объем необходимого белкового раствора. Несмотря на то, что для погрузки требуется 20 мкл, необходимо подготовить дополнительный объем (30 мл).
    3. Так как окончательный объем и концентрация известны, и концентрация белка супернатант фракции известно (определяется BCA анализ), рассчитать объем белка супернатант требуется с помощью уравнения:
      Vсупернатант (Vфинал x Cфинал)/C супернатант
      Таким образом, при сверхнатантной концентрации белка в 1,5 мг/мл,
      Vсупернатант й (30 л x 0,5 мг/мл)/1,5 мг/мл
      Vсупернатант 10 хл
    4. Рассчитайте количество буфера 4X Laemmli, необходимого для того, чтобы выдать 1-ю концентрацию в 30 мкл объема (30 мкл / 4 и 7,5 л). Примечание: 4X Laemmli буфер должен быть разбавлен до 1X прочности в подготовке образца.
    5. Рассчитать количество буфера гомогенизации, необходимого для довести объем до 30 мкл (и получить желаемую окончательную концентрацию белка 0,5 мг/мл):
    6. Подготовь образец путем вихревого затем пипетки 10 мл белка супернатант в 12,5 мл буфера гомогенизации. Добавьте 7,5 л буфера 4X Laemmli для рабочего раствора образца 30 мкл и концентрации 0,5 мг/мл.
  4. Подготовка всех образцов с использованием процедуры описаны, вихрь и кипятить в течение 5 минут.
    Примечание: Используйте винт верхней микроцентрифуг трубки для предотвращения утечки и открытия из-за давления во время кипения.
  5. Через 5 минут сразу же вывихним на лед. Загрузите 20 мкл образцового рабочего раствора на гель хорошо (10 мкг белка). Отдельные образцы белка SDS-PAGE на 12% трис-глицин гель.
    1. Используйте предварительно окрашенные белковой лестнице для подтверждения молекулярного веса. Бегущий буфер составляет 25 мм Трис-база, 192 м глицин, 0,1% SDS, и ddH2O, рН 8,3.
    2. Отдельные белки по электрофорезу: бегите на 80 V, чтобы очистить скважины (10 мин) и 125 V (примерно 1 ч; до тех пор, пока белковая лестница полностью не отделится) для решения белков.
  6. Выполните передачу белка в нитроцеллюлоза с помощью нитроцеллюлозы в буфере передачи трис-глицина (25 мМв Трис, 192 мМглицин, 0,04% SDS, 20% метанола и ddH2O, pH 8.3) за ночь на 40 В при 4 градусов по Цельсию.
  7. Вымойте нитроцеллюлозы пятна в 1x Tris солевой раствор (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl в ddH2O, рН 7,4) в течение 10 мин на RT. lncubate в Понсо S в течение 5 минут, то промыть в ddH2O, чтобы обеспечить грубую проверку эквивалентной загрузки белка. Сканирование изображения для сохранения записи для ноутбука и destain с помощью PBS.
    Примечание: Кроме того, мыть пятно в Милли-Я или ddH2O, содержащий HCl (0,2%) в течение примерно 5 мин. Сканирование для записи. Удалите пятно Ponceau S из мембраны последующим шагом инкубации (т.е. место в блокирующего буфера).
  8. Блок пятна в 5% обезжиренного сухого молока в ТС на 1 ч на RT и инкубировать 24h при 4oC с кролика антитирозин гидроксилазы (1:1000),анти-β-актин (1:200); анти-GFAP (1:1000) в 5% молока-TS.
  9. Вымойте помарки 3 x 5 мин в TS с 0.05% Tween-20 и 1 x 5 min в TS, после этого инкубировать в HRP-спряженных вторичных антителах (1:5000 в TS содержа 5% молоке), сопрягаемом к виду главным образом, для 2 h на RT.
  10. Приготовьте химилюминесцентный субстрат с использованием равных объемов растворов люминола и перекиси и нанесите на 1-3 мин. В темной комнате поместите пятно в пластиковый рукав для экспозиции пленки и подвергайте пленке; пленка затем разрабатывается с использованием автоматического процессора.
  11. Полоса пятна с коммерчески доступными зачистки буфера при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, мыть 3x 10 мин в ТС с 0,05% Tween-20, и 1x 10 мин в ТС, а затем reprobe для погрузки контроля или другого белка интереса.
  12. Количественная оценка сигналов с помощью программного обеспечения Image J для оптических измерений плотности и нормализации внутреннего контроля нагрузки β-actin.

7. Нейрохимия

  1. Ткань для анализа подготовлена, как описано выше в разделе 5.2. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для мобильного рецепта фазы.
    Примечание: Все реагенты должны быть ≥99,0% чистой и класса HPLC. Обеспечь целостность буфера с помощью чистой, выделенной стеклянной посуды и перемешать решетки. Мобильный фазовой буфер должен быть использован в течение семи дней после подготовки.
    1. Взвесь дигидроген фосфат и лимонную кислоту, добавьте 1 лddH 2O и смешайте в цилиндре с градуированным 2 л. Фильтровать раствор через мембрану GSTF 0,22 мкм.
      Примечание: Это максимизирует добычу загрязняющих веществ в фосфатах и лимонной кислоте, что помогает свести к минимуму фоновые токи.
    2. Добавьте OSA с последующим ацетонитрилом и раствором EDTA. Добавьте ДДХ2O класса HPLC примерно до 1900 мл до корректировки рН до 3,0 с фосфорной кислотой.
    3. Добавьте ddH2O класса HPLC к отметке 2-L, а затем вылейте в колбу 2-L. Добавить специальный бар перемешать, и дегазаации мобильной фазы, помешивая его под вакуумом в течение > 10 минут.
  2. Подготовь стандарты для допамина, и DOPAC и HVA для стандартных кривых. Фондовые растворы стандартов готовятся при 1 мг/мл в 0,3 Н PCA.
    1. Взвесить 12,4 мг допамина-HCl, и добавить 10,0 мл 0,3 N PCA, чтобы сделать 1 мг / мл допамина.
    2. Взвесьте 10.0 мг DOPAC, и добавьте 10.0 мл 0.3 N PCA, чтобы сделать 1 мг/мл DOPAC.
    3. Взвесьте 10.0 мг HVA, и добавьте 10.0 мл 0.3 N PCA для того чтобы сделать 1 mg/ml HVA.
  3. Подготовка рабочих стандартных решений из фондовых решений. Пятитой стандарты используются для создания кривой концентрации.
    1. Для измерения стриатального допамина приготовьте стандартные концентрации 12,5 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл и 200 нг/мл.
    2. Для стриатального DOPAC приготовьте стандартные концентрации 2,5 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл и 40 нг/мл.
    3. Для стриатального HVA приготовьте стандартные концентрации 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 40 нг/мл и 80 нг/мл.
    4. Создайте пятиточайные стандарты: разбавьте раствор дофамина 1 мг/мл до 5 мкг/мл с помощью 0,3N PCA. Разбавить 1 мг/мл раствора бульона DOPAC до 1 мкг/мл с использованием 0,3N PCA и разбавить 1 мг/мл раствора бульона HVA до 2 мкг/мл с использованием 0,3N PCA.
    5. Перенесите 1 мл 5 мкг/мл допамина, 1 мл 1 мкг/мл DOPAC и 1 мл 2 мкг/мл ХВА в 25-мл объемной колбы и довнесите объем до 25 мл марки с 0,3 Н PCA.
      Примечание: Смешанные стандарты в томтрической колбе содержат самую высокую концентрацию пятиточковых стандартов: 200 нг/мл допамина, 40 нг/мл DOPAC и 80 нг/мл HVA.
    6. Перенесите 1 мл смешанных стандартов в чистые 1,5 мл микроцентрифугных трубок. Выполните 1:1 серийное разбавление четыре раза для создания последующих четырехтокай стандартов.
      1. Например, до 250 мкл смешанных стандартов добавьте 250 мкл буфера выборки и вихря тщательно для получения смешанных стандартов при 50% от первоначальных концентраций; повторить процесс до достижения желаемых разбавлений.
  4. Подготовка системы HPLC (насос, автоамперлер, реверсивная колонка (C18, 150×3,2 мм, 3 мкм)). Очистить насос свежей мобильной фазой, чтобы заменить все предыдущие решения в системе HPLC и захваченные пузырьки воздуха свежей мобильной фазой. Охладить автозапомохать до 4 градусов по Цельсию. Разогреть столбец до 35 градусов по Цельсию, что снижает общее давление.
    1. Установите напряжение на уровне -150 мВ и 220 мВ для первого и второго электродов электрохимического детектора соответственно. Equilibrate системы, по крайней мере 2 ч, и в идеале на ночь, с мобильной фазы со скоростью потока 0,2 мл/мин.
      Примечание: Во время равноуданого можно было бы использовать ячейки, а базовое чтение контролировать. Стабильное чтение указывает на то, что система готова к использованию. В течение двух часов фазы эквилибрации позвольте мобильной фазе войти в контейнер для отходов вместо того, чтобы его циркулировать. После этого периода, передвижная фаза может быть рециркулирована всю ночь для equilibration.
    2. Как только эквилибрация завершена, отрегулируйте скорость потока мобильной фазы до 0,6 мл/мин. Ввись 20 мкл каждого из пятио пункта стандартов.
  5. Оттепель стриатальных образцов на льду, и ввести 2 х 20 мкл каждого образца в систему HPLC. Используйте стандарты в начале и случайным образом на протяжении каждого набора стриатальных образцов.
  6. Используйте программное обеспечение для анализа области под допамина, DOPAC, и HVA пиков, производимых по стандартам и образцам. Определите аналиты по времени удержания и измерению, сравнив область под пиком с 5-той кривой для соответствующего стандарта.
  7. Подготовка фракции гранул, как описано в разделе 5.2.3. Выполните анализ белка Лоури на стриатальные гранулы. Примечание: Этот анализ будет измерять количество белка, присутствуют в стриатальных образцов в мг / мл; эта информация используется для определения концентрации аналита нг/мг.

8. Иммуногистохимия

  1. GFAP/TH двойной иммунофлюоресценции
    1. Удалите трубки, содержащие секционно-среднебрюх из морозильной камеры -20 градусов по Цельсию, и довнесите до RT. Удалите секции тканей, содержащие субстантию нигра, из криоконсервативного раствора в подносе, содержащем PBS.
    2. Поместите секции тканей в полистироловые вставки с полиэфирной сеткой днища для свободно плавающей иммунохимии. Вымойте 3 х 5 мин в PBS.
    3. Передача секций на пластину 96-х пластин с 180-кл блок раствор (5% нормальной сыворотки осла, 1% PVP, 1% BSA и 0,3% Triton X-100 в PBS) в каждой хорошо. Инкубация 40 мин на RT.
      Примечание: Все шаги мытья и инкубации выполняются с легким возбуждением на шейкере.
    4. Передача секций в скважины, содержащие первичный раствор антитела (180 мкл на скважину). Инкубация в первичном антителе коктейль, кролик анти-GFAP (1:1000) и овец анти-TH (1:400) разбавленный в PBS с 1% BSA и 0,3% TX-100, для 24 ч при 4 градусов по Цельсию. IgG от первичного вида служит отрицательным иммуностимулятором.
    5. Инкубировать в вторичных антител коктейль (1:200 осла анти-кролик 568 и 1:200 FITC осла анти-овцы в PBS с 0,1% TX-100). Используйте фольгу для защиты раствора от света во время подготовки и инкубации; инкубировать на RT в течение 2 ч.
      1. Для отрицательного контроля инкубировать участки в IgG от первичного вида, разбавленного до той же концентрации, что и для первичных антител.
      2. Вымойте 2 х PBS и 1 х TS в течение 5 минут каждый на RT. Маунт ткани разделы на плюс слайды в монтажной среде с пятном Hoechst и coverslip.
    6. Инкубировать в вторичных антител коктейль (1:200 осла анти-кролик 568 и 1:200 FITC осла анти-овцы в PBS с 0,1% TX-100). Используйте фольгу для защиты раствора от света во время подготовки и инкубации; инкубировать на RT в течение 2 ч.
    7. Вымойте 2 х PBS и 1 х TS в течение 5 минут каждый на RT. Маунт ткани разделы на плюс слайды в монтажной среде с пятном Hoechst и coverslip.
    8. Защитите слайды от света и окисления до визуализации, сохраняя их в слайд-коробке при 4 градусах Цельсия.
    9. Проанализируйте отрицательный контроль сначала для определения фонового уровня флуоресценции, а затем оцените положительную иммунореактивность с помощью флуоресцентной микроскопии.
  2. Иммуногистохимия Иба1 с хромагенными осадками
    1. Удалите трубки, содержащие секционно-среднебрюх из морозильной камеры -20 градусов по Цельсию, и довнесите до RT. Удалите секции тканей, содержащие субстантию нигра, из криоконсервативного раствора в подносе, содержащем PBS.
    2. Поместите секции тканей в полистироловые вставки для свободно плавающей иммунохимии. Вымойте разделы 3 х 5 мин в PBS, и поместите разделы непосредственно в 12-хорошо пластины, содержащие предварительно нагретые 10 мМ лимонной кислоты моногидрат, рН 9,0, 80 градусов по Цельсию в течение 30 мин, для эпитопа поиска.
    3. Прохладный пластины 20 мин на RT. Возвращение разделов для вставок и мыть 3 х 5 мин в PBS.
    4. Передача секций на 96-хорошо пластины, содержащие 180-МК блокирующий раствор (10% нормальной сыворотки козы, 1% BSA в PBS) на колодец, и инкубировать 40 мин на RT.
    5. Передача секций скважинам, содержащим разбавленные первичные антитела в 180 мкл (1:1000 в 1% BSA-PBS). Инкубация на ночь при 4 градусах Цельсия.
    6. Передача разделов вставки. Вымойте 3 х 5 мин PBS и применять биотинилированные вторичные антитела (1:200 в 1,5% нормальной сыворотки-PBS) в течение 1 ч на RT.
    7. Подготовь решение ABC за 30 минут до использования. Вымойте 3 х 5 мин PBS и перейти на решение ABC для 1 ч на RT.
    8. Подготовь решение DAB в капюшоне. Вымойте 2x 5 мин в PBS и 1x 5 мин в TS, и инкубировать разделы в DAB.
      1. Разработка в течение 3-4 мин. Отрицательный контроль должен оставаться светлым цветом.
        Примечание: выполнить этот шаг в дым капот, как DAB является известным канцерогеном. Раствор перманганата калия 0,2 М приДДГ 2O для обеззараживания следует поддерживать в непосредственной близости в случае случайных капель.
    9. Промыть разделы кратко в ddH2O, затем в TS 3 х 5 мин. Гора разделы на плюс слайды и воздух сухой ночь в дым капот.
    10. Обеззараживание отходов DAB с равным объемом 0,2 М перманганата калия в ddH2O, вихрь, и инкубировать в дым капот на ночь перед хранением в надлежащим образом помечены DAB отходов бен в дым капот.
      Примечание: Отбеливатель решение не устраняет мутагенных свойств DAB.
      1. Обеззараживать предметы, которые необходимо повторно использовать (т.е. полистироловые вставки) и мыть моющим средством.
    11. Обезвоживаемый/счетчик слегка с cresyl фиолетовый (CV). Все шаги обезвоживания / мытья 3 мин: этанол 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 секунд), ddH2 0x 2, 95% этанола и ледниковой уксусной кислоты (0,1%) х 2, 100% этанола и ксилена.
    12. Coverslip в distyrene-толуол-ксилен монтажа среднего и сухой в дым капот.
    13. Наблюдайте положительную иммунореактивность с помощью светового микроскопа. IgG от первичного вида служит отрицательным иммуностимулятором.

9. Статистика

  1. Оценить различия между средствами с помощью одного пути анализа дисперсии (ANOVA) для сравнения различий между генотипом и двухповерхной ANOVA для сравнения различий между генотипом и токсикантной обработки. Используйте HSD-специальный анализ Tukey, когда различия наблюдаются при тестировании ANOVA(p≤0.05).
    Примечание: эксперименты (с n No 6-9 мышей / группы) выполняются как минимум два раза для обеспечения воспроизводимости.

Результаты

Эта парадигма воздействия токсинов может производить значительные и обнаруживаемые 20% истощения стриатального допамина в MPTP- против солевые инъекционные животных. Важно отметить, что различные партии MPTP может дать немного более или менее поражения; Таким образом, для лучшей точности, ...

Обсуждение

Конструкция этого исследования взаимодействия генно-окружающей среды позволила нам получить новую информацию о двойной природе изозима 5-LOX в нипростриатальной дорожке. Выполняя HPLC для измерения стриатальных моноамина после солевого или MPTP лечения в трансгеничных не хватает 5-LOX isozyme ...

Раскрытие информации

Раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения NIGMS 056062.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252for HPLC acid extraction
Tris BaseSigma-AldrichT1503for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE1644for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktailSigma-AldrichP5726for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813for IHC
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo23225for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXfor SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protein ladder
GlycineSigma-AldrichG7126for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent American MasterTech ScientificSPM1057Cmethanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagentSigma-AldrichS9888saline and buffers
Nonfat dry milk powderCarnationn/afor immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid Sigma-AldrichP7170for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonalChemicon/MilliporeAB1542for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonalPel-Freez BiologicalsP40101-0for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbitSigma-AldrichA2066for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonalChemicon/MilliporeAB5804for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonalCovance Inc.SMI-22Rfor immunoblotting
Tween-20Sigma-AldrichP1379for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated Fisher Scientific31462for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31480for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31430for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce/Thermo34078for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in Pierce/Thermo34089for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% Sigma-AldrichC1909for IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLfor IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilizedSigma-AldrichA3294for IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) Vector LaboratoriesPK-4001for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30%Sigma-Aldrich216763for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Afor IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcoholSigma-AldrichR8382dehydration for IHC
100% Absolute ethanolMallinckrodt7019-10dehydration for IHC
Acetic acidSigma-AldrichA6283destaining for IHC
XyleneSigma-Aldrich534056clearing agent for IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium American MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganateSigma-Aldrich223468to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochlorideSigma-AldrichH8502for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)Sigma-Aldrich850217for HPLC
Homovanillic acid (HVA)Sigma-AldrichH1252for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSigma-Aldrich71504for HPLC
Citric acid monohydrateSigma-AldrichC1909for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA)Sigma-AldrichO8380for HPLC
EDTASigma-AldrichE1644for HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O)Milliporefor HPLC
0.22 µm GSTF membraneMilliporefor filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeEppendorf5414R
ESA MD-150 reverse-phase column ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Electrochemical detectorESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical CellESA5011A
Chromeleon softwareDionex
Eclipse E400NikonE400light/fluorescent microscope
Disposable mouse cageAncareN10HT
Microfilter topAncareN10MBT
5-LOX- deficient miceThe Jackson Laboratory004155
12/15-LOX-deficient miceThe Jackson Laboratory002778

Ссылки

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

83MPTPIba1THGFAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены