VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления

Резюме

Вирус индуцированного глушителей гена является полезным инструментом для идентификации генов, участвующих в нехозяев устойчивости растений. Мы продемонстрировать использование бактериальных патогенов выразив GFPuv в определении генов замолчать растения восприимчивы к нехозяев патогенов. Такой подход легко, быстро и облегчает скрининг большого масштаба и аналогичный протокол может быть применен к изучению различных других растительно-микробных взаимодействий.

Аннотация

Нехозяев устойчивость к болезням растений от бактериальных патогенов контролируется сложные пути защиты. Понимание этого механизма имеет важное значение для разработки прочных устойчивых к болезням растений от широкого спектра возбудителей. Вирус индуцированного глушителей гена (VIGS) на основе вперед генетика скрининга является полезным подходом для идентификации защиты растений гены придания нехозяев сопротивления. Вирусу табачной трещотка (ТЗМ) вектора на основе VIGS является наиболее эффективным VIGS вектор, дата и была эффективно использована чтобы заставить замолчать эндогенных генов-мишеней в Nicotiana benthamiana.

В этой рукописи мы демонстрируем вперед скрининга генетики подходом для замалчивания отдельных клонов из библиотеки кДНК в N. benthamiana и оценки реакции генов растений для замолчать под угрозой нехозяев сопротивление нехозяев патогенов, Pseudomonas syringae ру. томатным T1, П. syringae ру. GlycИНЕА, и X. сатрезЫз PV. vesicatoria. Эти бактериальные патогены спроектированы так, чтобы белок экспресс GFPuv и их зеленые флуоресцирующие колонии можно увидеть невооруженным глазом при УФ-света в нехозяев патоген инокулированных растений, если молчать целевой ген участвует в передаче нехозяев сопротивления. Это облегчает надежное и быстрое определение гена замолчать растения восприимчивы к нехозяев патогенов. Кроме того, перспективным информации ген-кандидат может быть известна последовательность вставки генов растений в ТРВ вектор. Здесь мы показываем, высокая пропускная способность VIGS-опосредованной вперед генетики идентифицировать гены, участвующие в нехозяев сопротивления. Примерно, 100 кДНК может быть индивидуально замолчать примерно в две-три недели и их актуальность в нехозяев сопротивления против нескольких нехозяев бактериальных патогенов могут быть изучены через неделю после этого. В этой рукописи мы перечисляем подробные этапы этого скрининга. VIGS-опосредованной вперед генетики Screeniнг подход можно распространить не только на выявление генов, участвующих в нехозяев сопротивления, но и к изучению генов придания нескольких биотических и абиотических допусков по ударным нагрузкам в различных видов растений.

Введение

Нехозяев сопротивление сопротивление всех видов растений против расы конкретного патогена ^1,2. Это придает широкий спектр и прочный устойчивость к болезням в растениях ^2,3. Тем не менее, его механизм, особенно в отношении патогенных бактерий, не очень хорошо понял ^4. Скрининг на мутантов или молчать растений, которые компромисс нехозяев сопротивление и высокий профилирования транскрипт пропускную способность для идентификации дифференциально экспрессированных генов во время нехозяев сопротивление ^5-9 два основных подхода ранее использовались для рассечения бактериальной устойчивости нехозяев. Потому нехозяев сопротивления контролируется сложный механизм (ы) ⁴ с участием многих генов, высокая пропускная способность функционального подхода для геномной идентификации генов имеет решающее значение для лучшего понимания механизма сопротивления нехозяев (ы).

Вирус-индуцированные генов (VIGS) успешно используется, чтобы заставить замолчать эндогенных заводагенов во многих видах растений ^10,11. Nicotiana benthamiana является одним из наиболее подходящих растений для VIGS ^10,12 и проект генома теперь доступен ^13. рэтл вирус (ТЗМ) на основе VIGS широко используется в качестве обратной генетики инструмент Для характеристики генов, участвующих в нехозяев сопротивления ^2,4,14. Это VIGS векторов и производные теперь доступны через Arabidopsis Биологические ресурсный центр (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS была также использована в качестве инструмента вперед генетики для идентификации генов, участвующих в иммунитете растений ^15-17, особенно нехозяев сопротивление ^6,18. Оценка реакции гиперчувствительности (HR)-опосредованная гибель клеток индуцированные растений от специфических патогенов нехозяев и оценки вызванный болезнью гибели клеток два основных анализов в основном используется для identifyinг восприимчивы замолчать ген растений. Тем не менее, HR гибель клеток индуцируется только против второго рода патогенов нехозяев а не против Тип-I нехозяев патогенов ^2. Следовательно, HR анализов не универсален и может применяться для выявления нехозяев стратегии сопротивления используется растениями, особенно в отношении широкого спектра типов патогенов Я нехозяев. Кроме того, частичную потерю нехозяев сопротивление в гене молчать растение не всегда приводит к симптомов заболевания ⁶ и, следовательно, болезнь скоринг не может быть использована для идентификации растений нехозяев снижения сопротивления. Наоборот, оценки роста нехозяев патогенов в геном растения замолчать является лучшим методом изучения потери нехозяев сопротивления в геном растения замолчать.

По сравнению с обычным анализом роста ^6,19, более быстрый метод оценки нехозяев бактериального роста на гене молчать растений можно сократить время, необходимое для скрининга вперед генетики. Мы ранее сообщалось метод наблюдения бактерийл рост патогена на листьях невооруженным глазом под действием ультрафиолетового (УФ) света с помощью бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) ^19. В этой рукописи мы продемонстрировать полезность GFPuv выразив нехозяев бактериальных патогенов для легкой идентификации гена замолчать растения, которые оказываются под угрозой для нехозяев сопротивления. Эта методика является точной идентификации восприимчивых растений и поддаются для высокопроизводительного скрининга.

протокол

1. Рост растений и молчанию гена-мишени

1. Условий роста растений:
   1. Сейте Н. benthamiana семена на почвенно-менее заливки смеси Metro-Mix 350 и прорастают семена в камеру роста. Любые другие земли или менее носитель также может быть использован вместо Метро-Микс.
   2. Пересадка трехнедельного сеянцы в отдельные горшки и выращивают их в теплице поддерживают на уровне 21 ± 2 ° С наряду с другими условиями роста, как описано ранее в литературе ^12. От двух до трех дней после пересадки растений могут быть использованы для ТРВ прививки.
2. Рост TRV2 клоны:
   ТРВ является двудольный вируса и его генома состоит из RNA1 и РНК2. RNA1 кодирует РНК-зависимой РНК-полимеразой и перемещение белка ^20,21. РНК2 кодирует белок оболочки (СР) и два неструктурных белков из субгеномных РНК ^21. Оба RNA1 РНК2 и необходимы для формирования созрел Вирнам частиц и их распространение ^20,21. Конструирование кДНК библиотеки в векторном TRV2 описан в предыдущей литературе ^22,23. Вкратце, библиотеку VIGS используемые в данном исследовании была построена из РНК, выделенной из ткани листьев подвергаются различным биотическим и абиотическим элиситоров.
   1. Вынуть Agrobacterium (штамма GV2260), содержащий кДНК-клоны в вектор TRV2 (96-луночный планшет) из морозильной камеры. Постепенно оттаивать их и после культур до комнатной температуры, инокуляции индивидуальной культуры Agrobacterium на Лурия-Бертани (LB) агаром с рифампицином (10 мкг / мл) и канамицином (50 мкг / мл) с использованием 96-контактного репликатор.
   2. Инкубируют планшеты при 28 ° С в течение двух дней. Мы обычно растут четыре повторных колоний для каждого клона в местах с достаточной посевной Agrobacterium доступна для укола прививки двух заводов. Выполните все шаги в стерильных условиях.
3. VIGS:
   1. РастиAgrobacterium (GV2260) проведение TRV1 при 28 ° С в жидкой среде LB с антибиотиками, упомянутых выше. Урожай клетки центрифугированием с выращивали в течение ночи культуры повторно суспендировать в прививкой буфером (10 мМ MES, рН 5,5, 200 мкМ ацетосирингона) и инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре на шейкере при 50 оборотах в минуту.
   2. Урожай клетки центрифугированием и повторно суспендировать в 5 мМ MES-буфер (рН 5,5) и инокулята (OD ₆₀₀ = 0,3) в абаксиальный стороне 3-4 N. benthamiana оставляет помощью безыгольного шприца. Подробные процедуры прививки было показано в предыдущих литературе ^24. Позже, на месте TRV1 прививки, прививки соответствующие TRV2 колонии покалывания листья с зубочисткой.
   3. Поддерживайте растений адекватное питание как энергичный рост важны для эффективной VIGS ^12. Около двух недель после прививки стенограммы целевых генов начнут урезать и растения готовы к патоген INOCulation в три недели после прививки ТРВ.

2. Подготовка нехозяев Возбудитель культур и растений Прививка

1. Подробности патогенов используемые в этом исследовании:
   Pseudomonas syringae ру. Tabaci, П. syringae ру. томатным T1, П. syringae ру. glycinea и Xanthomonas сатрезЫз PV. vesicatoria используются в данном исследовании. Расти P. syringae штаммов в B Кинга (KB) жидкой среде, содержащей рифампицин (10 мкг / мл), канамицин (50 мкг / мл) при 28 ° С в течение 12 часов. Расти X. сатрезЫз PV. vesicatoria в жидкой среде LB в течение 16 часов. Все патогенные питать плазмиды, которые могут выразить GFPuv, как описано ранее в литературе ^19.
2. Подготовка патогеном культур для прививки растений:
   1. Урожай бактериальных клеток путем центрифугирования и подтвердить наличие зеленой флуоресценции с использованием длинных ваvelength УФ-лампы в темноте. Промыть клетки в два раза стерильной водой и повторно суспендировать их до нужной концентрации с использованием стерильной воды.
   2. Привить соответствующего возбудителя (ы) на абаксиальной стороны гена-мишени замолчать листьев ^(5-го по ^{8-е место)} в виде пятен (диаметром около 1,5 см). Несколько патогенов нехозяев одновременно могут быть проверены на их рост в гене-мишени молчать растений. Одновременно прививку хозяина патогеном, как это может быть использовано в качестве положительного контроля для просмотра в плантаций роста бактерий. Также прививки векторного управления (ТРВ :: 00) растений.

3. Наблюдение в Планта рост бактериальных патогенов

1. Expose привиты листья длиной волны ультрафиолетового света в темноте. Бактериальные колонии можно рассматривать как зеленый флуоресцентный точек в абаксиальный стороне листа на фоне красной флуоресценции, испускаемой поверхности листа.
2. Соблюдайте рост патогенныхот 2 дней после инокуляции (точек на дюйм) до 5 точек на дюйм. Каждый день наблюдений в течение этого интервала времени является необходимым.
3. После того, как первый экран, краткий перечень которых клонов глушителей приводит к росту одного или более нехозяев патогена (ов).
4. Повтор VIGS для отобранных клонов и снова проверить реакцию гена молчать растений нехозяев патогена (ов). Этот второй уровень скрининга делается для удаления ложных срабатываний, полученных в ходе первого экрана.

4. Подтверждение номинанта Растения для скомпрометированных нехозяев сопротивления

1. Silence кДНК-клонов, выбранных на экране, как описано выше. Инокулируйте целое растение с нехозяев патогена (ы) путем погружения растений с соответствующим патогеном культур с 0,01% (объем / объем) Silwet L-77 и подвергание подводных растений в вакууме в течение 3 - 5 мин. Количественная роста бактерий на обычном анализе роста ^6,18,19 как описано ниже.
2. В 0 часов после прививки (HPI),3 точек на дюйм и 5 точек на дюйм, собрать два образца лист из пяти биологических повторяет для каждого патогена нехозяев (ы) привиты листья использованием листьев удар (0,5 см ^2). Измельчить листья образцы, серийные разбавленные и пластины SAP на KB агар среде с добавлением соответствующих антибиотиков и инкубировать при 28 ° С в течение 2 дней. Подсчет колоний бактерий использованием счетчика колоний и рассчитать рост бактерий в листьях, как описано ранее в литературе ^6.
3. Растения чувствительны к нехозяев патогена (ы) должны показать большее количество возбудителя рост по сравнению с векторным управлением.

5. Секвенирование вставки и идентификация гена-мишени

1. Выполнение ПЦР колоний для выбранного клона использованием attB1 и attB2 праймеров или с использованием праймеров, фланкирующих сайт клонирования в TRV2 вектор. Запуск продукта ПЦР на гель и проверка для амплификации одной полосы.
2. Завод вставки гена в вектор TRV2 можно секвенировать с использованием ATTBпраймера или праймеров фланговые сайт клонирования.
3. Выполнение BLAST с использованием последовательности, и идентифицировать ген деталей.
4. Получить полную последовательность гена длиной вместе с ООН-транслированные области (НТО).
5. Выбор 300-400 п.о. фрагментов из трех различных областей последовательность и клонировать их в TRV2 вектор. VIGS самостоятельно выполнять с использованием всех трех VIGS конструкций и подтвердите компромисс нехозяев сопротивления во всех трех генов замолчать растений.

Результаты

Основной целью данного исследования является демонстрация метода для легкой и точной идентификации гена замолчать Н. benthamiana растения, которые оказываются под угрозой для нехозяев сопротивления. Существуют четыре основных этапа в этой методологии. Первый шаг заключается в индиви...

Обсуждение

Иммунитет растений ограничивает рост нехозяев патогенов и, следовательно, мало или вообще не зеленая флуоресценция не выпустили из векторного управления установкой оставляет засевают нехозяев патогена под ультрафиолетовым светом длиной волны (рис. 3D). Однако, когда ген, учас...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30