Тканевая инженерия: Строительство многоклеточного 3D строительные леса на поставки слоистых сотовых листов

Резюме

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Аннотация

Многие ткани, такие как взрослых человеческих сердцах, не в состоянии адекватно восстановить после повреждений. ^2,3 Стратегии тканевой инженерии предложить инновации, чтобы помочь организму в восстановлении и ремонте. Например, TE подходы могут быть в состоянии ослабить ремоделирования сердца после инфаркта миокарда (ИМ) и, возможно, увеличить общий функцию сердца к почти нормальной предварительно МП уровня. ⁴ Как и в любой функциональной ткани, успешной регенерации сердечной ткани предполагает своевременную доставку множество различных типов ячеек с внешним стимулам в пользу интеграции и выживания имплантированной клеточной / тканевой трансплантат. Инженерные ткани должны обратиться нескольких параметров, включая: растворимые сигналы, клетки к клетке взаимодействия и матричные материалы оцениваются как средств доставки, их влияние на выживаемость клеток, прочность материала, и оказанию организации клетки к ткани. Исследования, использующие прямой впрыск привитых клеток только игнорировать эти важные элементы. ^2,5,6Дизайн ткани сочетая эти ингредиенты до сих пор не разработаны. Здесь мы приведем пример интегрированных конструкций с использованием наслоение узорчатыми клеточных листов с двумя различными типами биологических полученных материалов, содержащих тип орган клеток цель и эндотелиальные клетки для повышения новое образование сосудов в "ткани". Хотя эти исследования сосредоточены на генерации сердца, как ткани, эта конструкция ткань может быть применен к другим, чем сердце с минимальными дизайна и существенных изменениях, многих органов, и предназначается, чтобы быть вне-полки продукт для регенеративной терапии. Протокол содержит пять детальные шаги. Чувствительны к температуре поли (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) используется для покрытия чашках для тканевых культур. Затем конкретной ткани клетки культивировали на поверхности с покрытием пластин / micropattern поверхностей с образованием клеток листы с сильным боковым спаек. В-третьих, базовая матрица создается для ткани путем объединения пористую матрицу с неоваскулярной Permissiве гидрогели и эндотелиальные клетки. Наконец, клеточные листы поднимаются из блюд в pNIPAAM покрытием и переносили в базовом элементе, в результате чего полное конструкцию.

Введение

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

протокол

1 Создание Плиты pNIPAAM покрытием

1. Растворить 2,6 г pNIPAAM в 2 мл 60% толуола / 40% раствора гексана.
2. Смесь нагревают до 60 ° С в течение 10 мин с перемешиванием, до тех пор, pNIPAAM не растворится.
3. Вырезать фильтровальную бумагу в 60 мм круга диаметром и бумагу в воронке Бюхнера.
4. Фильтр решение через воронку Бюхнера в предварительно взвешенный стеклянный стакан (не использовать пластик, как гексан будет оплавление пластмассовых деталей).
5. Стакан помещают и содержание под колокольню вакууме (24 фунтов на квадратный дюйм) O / N (16 ч). Примечание: До остаток не взаимодействует с изопропил он будет окислять поэтому убедитесь, что он не вступает в контакт с кислородом.
6. Взвесьте стакан установить вес pNIPAAM.
7. Добавить изопропиловый спирт в pNIPAAM, создавая 50/50 вес / вес раствора.
8. Поместите 2 мл раствора на поверхности планшета для культуры ткани, и слой в течение 5 мин в УФ-свете.
9. Промыть пластины с 2 мл теплой PBS в два разаПеред использованием в клеточной культуре.

2 Создание Сотовые листы

Примечание: Сотовые листы для первичных клеток органа-мишени могут быть созданы с использованием ряда различных методов, или путем нанесения культуры ткани поверхностей с термо-полимера реагируют, как описано здесь. Предварительно покрытых термочувствительных пластин предлагают также ряда поставщиков.

Примечание: Этот протокол является для культуры с использованием 35 мм блюдо. Вкратце, клетки сначала инкубировали при 37 ° С в течение не менее 24 ч при слиянии установить боковые соединения между соседними ячейками. Чтобы освободить сотовые листы, плиты подвергаются воздействию температур ниже 32 ° C. Ячейка лист затем переносили в сильной базовой волокнистой матрицы, содержащей неоваскулярной разрешающий гидрогель с эндотелиальными клетками сосудов.

1. Изолировать клеточной популяции. Примечание: Этот метод зависит от индивидуальных процедур вывода и типа клеток. Крыса аорты гладкая муSCLE клетки (RASMC) используются в данном примере. Эти первичные клетки гладкой мускулатуры, выделенные из брюшной аорты крысы.
2. Промывают клетки 2 мл теплого PBS.
3. Добавить 3 мл трипсина (или другого раскалывания / диссоциации раствора) к клеткам в течение 5 мин.
4. Блокировка трипсина путем добавления 3 мл культуральной среды, или фосфатного буферного раствора (PBS), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
5. Собирают клетки в коническую пробирку и считать аликвоту.
6. Спин клеток при 1000 оборотов в минуту (228 мкг) в течение 5 мин.
7. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в их питательной среды (SmGM2 плюс пуля комплект питательная среда используется для RASMC).
8. Поместите носителей, содержащих клетки на 35 мм термочувствительной пластины - пластины, покрытой pNIPAAM в концентрации, которая будет достичь 100% слияния. Примечание: RASMCs, что число было установлено, что 100 000 клеток / см ^2. Тем не менее, в связи с потерей клеток во время прохождения, 120% от этой VA LUE используется.
9. Поместите в инкубатор при 37 ° CO / N. Примечание: Важно, чтобы поддерживать клетки при 37 ° С, чтобы поддерживать клеточную адгезию к пластине.

3 Получение Учредительном Matrix

Примечание: Различные 3D волокнистые матрицы могут быть использованы в слой волокнистой матрицы сильное между тонкими листами клеток. Вот несколько примеров: Gelfoam, биостекло, природные acellularized материалы ²⁶ или nanospun материалов ^27,28 свиной матрица мочевого пузыря (UBM) используется в этих исследованиях был щедро обеспечена от нашей сотрудника, доктора Badylak ^29.

1. Перед использованием определения характеристик матрицы включая отсутствие клеточной содержания, если используется матрица decellularized, ^27,28 конкретных жизнеспособность клеток, а пустое пространство. ²²
2. Обрежьте предварительно стерилизуют в матрицу желаемого размера и формы. Примечание: Здесь, перфорации используется для резки диаметром 4 мм круг.

ve_title "> 4. посевные эндотелиальных клеток в неоваскулярных Permissive гидрогеля

Примечание: Эндотелиальные клетки могут быть получены из различных источников, в том числе дифференциации из стволовых клеток или клеток-предшественников. Здесь HUVECs используются.

1. Используйте любой разрешительный гидрогель (фибрин, коллаген гели), если сшивающего время является достаточно коротким, чтобы позволить клеткам оставаться жизнеспособным. Примечание: Здесь Гиалуроновая кислота (ГК) на основе гель сшитой с дисульфидный мостик используется.
2. Подготовьте гидрогель HA в соответствии с протоколом компании.
3. Соберите эндотелиальные клетки и разогнать в одном решении клеток с использованием 1x трипсин. Примечание: Accutase или клеточной диссоциации буфера также могут быть использованы для одного дисперсии клеток.
4. Отключение фермента трипсина с использованием такого же количества ингибитора трипсина сои (если это важно, что клетки не вступают в контакт с сывороткой) или 10% FBS в PBS, сбор раствора / клеток в 15 мл коническую трубку.
5. Cр а ф клетки, и рассчитать объем необходимой для размеров патч (ранее количественно). Примечание: Для 4 мм патча, используются здесь 2000000 эндотелиальные клетки.
6. Выписка 2000000 клетки, и поместите в новый 15 мл коническую трубку.
7. Отжим при (228 мкг) в течение 5 мин.
8. Аспирируйте супернатант, оставляя клетки в виде гранул в конической трубе.
9. Смешать жидкие материалы HA и желатин в 1: 1 рационе. Затем добавляют 80% от общего объема в коническую пробирку, содержащую осадок.
10. Ресуспендируют эндотелиальные клетки в 1: 1 HA / смесь желатина
11. Поместите приостановленные клетки в смеси HA / желатина в базовой волокнистой матрицы со стадии 2.
12. Добавить 1/5 (20 процентов) от общего объема требуемой из сшивающего агента
13. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.

5 Выделение Сотовые листы

1. Снимите 35 мм pNIPAAM обращению пластин, содержащих ячейки из инкубатора и место в капот культуре клеток приRT.
2. Быстро аспирации СМИ из клеток, и добавьте 2 мл 6% нормальной желатина, который был нагрет до 37 ° С.
3. В то время как желатин еще теплый, разместить кристаллической решетки металла в желатин, погружая его ниже поверхности нормальной желатина (Видео 1).
4. Поместите всю плиту на льду в течение 5 до 7 мин, позволяя желатин, чтобы укрепиться.
5. После 7 мин, используют шпатель, чтобы тщательно отделить желатиновые края со стороны пластины, а затем с помощью щипцов для подъема решетки металла от пластины Примечание: 6% желатина, и клетка лист должен снять с решеткой.
6. Перемещение клеток листа в чашку и поместить поверх базовой волокнистой матрицы-гидрогель комбинации, тщательно установив решетку в верхней части конструкции. Примечание: верхушечный сторона ячейки листа по-прежнему будет в верхнем положении.
7. Добавить 2 мл теплой СМИ (37 ° C).
8. Инкубируйте O / N позволяет лист клеток прилипать к поверхности гидрогеля.
9. Удалить тон решетки металла после решение согревает (примерно 1 час), или на следующий день.

Результаты

Блок-схема (рисунок 1) показывает общую способ изготовления многослойной патч. Сотовые листы отделены от pNIPAAM обработанной пластины, понижая температуру ниже 32 ° C. Затем клетки лист помещается на верхней части поперечно-сшитого гидрогеля, содержащей эндотелиальные клетки выс?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе включают: покрытие поверхностей пластины с thermoresponsive полимера и манипулирования клеток листы после охлаждения пластин. Поскольку различные клетки обладают различными физическими свойствами, как адгезивности, время подъема должна быть оптимизирована для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42