Исследование клеточной миграции в микроизготовленном каналов

Резюме

Количественный метод исследования спонтанной миграцию клеток в одномерном замкнутом микросреды описано. Этот метод использует микроизготовленном каналов и может быть использован для изучения миграции большого числа клеток при различных условиях в отдельных экспериментах.

Аннотация

Описанный здесь метод позволяет изучать миграцию клеток в ограниченном объеме в одном измерении. Он основан на использовании микроизготовленном каналов, которые налагают поляризованный фенотип в клетках физическими ограничениями. После того, как внутри каналов, клетки имеют только две возможности: двигаться вперед или назад. Эта упрощенная миграция, в которой направленность ограничена облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение количественных параметров для описания движения клеток. Эти параметры включают скорость клеток, изменения в направлении и паузы во время движения. Микроканалы также совместимы с использованием флуоресцентных маркеров, поэтому подходят для изучения локализации внутриклеточных органелл и сооружений во время миграции клеток в высоком разрешении. И, наконец, поверхность каналов могут быть функциональными с различными субстратами, что позволяет контролировать адгезионных свойств каналов или изучении haptotaxis. Таким образом, система чпрежде чем описано предназначен для анализа миграции больших количествах клеток в условиях, в которых как геометрия и биохимический характер среды находящимися под контролем, способствуя нормализации и воспроизводимость независимых экспериментов.

Введение

Миграция представляет собой комплекс клеточные функции, что имеет важное значение для многих физиологических процессов в многоклеточных организмов, в том числе развития, иммунного ответа и регенерации тканей. Кроме того, некоторые патологические состояния, такие как опухолевой инвазии и метастазирования полагаться на клеточной подвижности ^1. По этим причинам, миграции клеток стала одним из основных области исследования в контексте фундаментальных и трансляционных исследований. В естественных условиях, большинство тканей характеризуются богатой внеклеточного матрикса и высокой плотности клеток. Миграция клеток таким образом, в физиологических условиях, происходит в сложном ограниченном окружении. Классически, скорее всего, в силу исторических причин и технических ограничений, миграции клеток изучалось в плоских 2D системах, которые не воспроизводят многие свойства окружающей среды, найденных в тканях, таких как заключения. Кроме того, факторы, как клеточной адгезии, которые необходимы для подвижности в 2D, были недавно показал, чтобы не быть necessaRily требуется для миграции в естественных условиях или внутри гелей, предполагая, что механизмы, которые управляют клеток передвижения в 2D и в других средах различны ^2. Несколько системы были разработаны, чтобы имитировать сложные свойства тканей, самых известных гелей существо коллагена, которые направлены на обобщал свойства внеклеточного матрикса состава ^3. Здесь мы предлагаем микроканалов в качестве простого дополнительного метода, который позволяет миграцию исследование клеток в одном измерении под замкнутом среде.

В этой системе клетки мигрируют вместе микроканалов, в которую они поступают спонтанно. Миграционные клетки затем приобретают форму каналов, приняв трубчатую геометрию, которая, скорее всего, усиливает их полярность. Линейное перемещение клеток в каналах позволяет отслеживать автоматический клеток и извлечение количественных параметров из экспериментов. С технической точки зрения, эта система легко и гибко. Coatinг стенках канала можно манипулировать, размер и форма каналов могут быть адаптированы, и большое количество клеток могут быть проанализированы в отдельных экспериментах. Эта система может быть также уменьшено, чтобы выполнить средний анализ экраном диапазон молекул, участвующих в клеточной подвижности. Протокол, описанный здесь был стандартизирован с использованием дендритных клеток (DC) в качестве клеточной модели. Эти клетки играют ключевую роль в иммунной системе, как они участвуют в инициации и поддержании специфического иммунного ответа ^4. Экстракорпоральное, ДК было показано, спонтанно перейти в закрытых средах и поэтому является хорошей моделью для изучения подвижность клеток в микроканалов ^5,6 . Важно отметить, что эта система может быть расширена для анализа миграции любой другой тип клеток подвижных как Т-лимфоциты, нейтрофилы, или опухолевых клеток ^7-9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Важное примечание: Этот протокол предполагает, что формы, содержащий форму для требуемых микроканалов уже сделан. Дополнительная информация о подготовке пресс-формы уже опубликованы ^10. Этот протокол также предполагает, что ДК костного мозга культура известна.

1. Чип Изготовление

1. Смешайте PDMS масло и отвердитель при массовом соотношении 10:01 в пластмассовой чашке. Смешайте оба соединения тщательно.
2. В ролях микс над опорными микроканалов плесени. Общая высота должна быть от 0,5-1 см.
3. Удалить пузырьки воздуха в вакуумном банку колокол в течение 1 часа.
4. Харден PDMS в формы, поместив последний в духовке в течение 2 часов при 65 ° С
5. После того, как PDMS является при комнатной температуре, вырезать большой кусок вокруг структуры с хирургическим скальпелем и очистить его от плесени (рис. 1А).
6. Сверлить отверстия, где клетки будет выведена (как правило, 2 мм) и размер PDMSс хирургическим скальпелем по размеру к стеклянным дном блюда, в которых миграция будет начисленных (рис. 1b). Прежде чем продолжить, удалить остатки пыли с блюдо, используя объектив бумагой для очистки. Это способствует связывание PDMS к стеклу, описанной в шаге 1.10.
7. Очистите малоформатной чип PDMS, содержащий каналы, придерживаясь и пилинг клейкую ленту на структуру сторон.
8. Разрушать ультразвуком куски PDMS 30 сек в 70% этаноле, чтобы удалить пыль и небольшие PDMS частицы. Высушите их быстро после этого путем продувки свежим воздухом.
9. Активируйте PDMS (Сооружения вверх) и чашки для культивирования по воздуха (или кислорода) плазменная обработка в течение 30 сек при 300 мторр.
10. Поместите оба активированных поверхностей в контакте постоянно наклеить PDMS с подложкой. При необходимости использовать металлические щипцы слегка нажать на верхней части PDMS, чтобы заставить контакт между полимером и стекло тарелки (рис. 1в).
11. Инкубируйте чип в печи при 65 ° С FOг 1 час укреплять связывания.

2. Покрытие микроканалов

1. Активируйте всю структуру воздушной плазмы на 300 мторр в течение 1 мин. Это будет способствовать вступление жидкости в каналах на следующем шаге.
2. Быстро Заполнить отверстия входа чипа с фибронектина в концентрации 10 мкг / мл в воде. Другие субстраты, такие как ПЭГ может быть использована для изменения клеток присоединения к стенкам канала. Обратите внимание, что жидкость распространяется по всей структуре. Это можно легко проверить на глаз под регулярным света или с помощью обычного светлое поле микроскопа.
   Примечание: В очень небольших структур, в которых диффузия труднее, вход жидкости в каналах может быть принудительно путем размещения структуры в вакуумном колоколе банку в течение по крайней мере 15 мин. Для проверки эффективности покрытия флуоресцентные субстраты могут быть использованы (рис. 2).
3. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, чтобы позволить адсорбцию фибронектина или любой другой SUBST покрытияСкорость к стенкам каналов.
4. Вымойте структуры 3x с PBS, чтобы удалить nonbound подложку.
5. После промывки перейти к протоколу 3 или хранить чип при 4 ° С для последующего использования (24 ч максимум).

3. Сотовый Загрузка

1. Снимите PBS от пластины и заполнить микросистему с клеточной среде. Пусть инкубировать в течение 1 часа, чтобы насытить каналы с среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с наркотиками, как молекулы ингибиторов, рекомендуется, чтобы preincubate каналы в среде, содержащей препарат в правильной концентрации. Кроме того, некоторые лекарственные препараты, как правило, для растворения в структуре PDMS что снижает эффективную концентрацию. Некоторые решения были предложены, чтобы противодействовать этой проблемы ^11-12.
2. Удалить плавающие РС и восстановить полу-прилипшие клетки путем промывки культуральной среде. Граф клеток с помощью гемоцитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ядра изображений, 33342 окрашивание Хехст может быть достигнуто заранее вcubating 2 х 10 ⁶ клеток в течение 30 мин с красителем на 200 нг / мл в полной среде. Промыть дважды центрифугированием для удаления избытка красителя, прежде чем продолжить протокол.
3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин (скорость и время может быть различным в зависимости от типа клеток) и отбросить среды. Развести осадок, чтобы достичь концентрации 20 × 10 ⁶ клеток / мл.
4. Удалить избыток среды от пластины и очистите отверстия входа в структуре PDMS с помощью микропипетки. Заполните записи с 5 мкл раствора клеток достичь количества 1 х 10 ⁵ клеток в каждом отверстии входа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая плотность клеток требуется, чтобы способствовать контакт клеток с каналов. Низкая плотность клеток может привести к низким числом клеток внутри каналов и отказа эксперимента.
5. Инкубируйте микрочип в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе. Добавить 2 мл полной среды в эксперименте блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся структура PDMS должна бе покрыта во избежание сушку клеток в ходе эксперимента. Если 2 мл не хватает, добавить больше среднего, чтобы полностью покрыть структуру PDMS.

4. Изображений

1. Протирайте внешние поверхности дна посуды с очистки объектива ткани до размещения пластин под микроскопом.
2. Для анализа миграции в большого числа клеток, использовать 10-кратным увеличением и широким освещения поля в СО ₂ и температуры оборудованной видео-микроскопа (рис. 3). Для облегчения отслеживания клеток, Хехст окрашивание и ультрафиолетовый свет может быть использован (см. шаг 3.2). Миграция может быть также проанализированы с помощью конфокальной микроскопии того, чтобы получить более высокое разрешение клеточных структур во время миграции.
3. Для покадровой микроскопии в 10 раз, выбрать частоту времени в соответствии с ожидаемой скоростью клеток (обычно 2 мин для дендритных клеток, мигрирующих со скоростью 5 мкм / мин).
   Примечание: Протокол, описанный здесь делает пOT включать анализ параметров миграции клеток. Несколько пунктов перечислены в обсуждении, чтобы консультировать читателей о том, как приступить к извлекать информацию из покадровой фильмов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В каждом эксперименте поверхность PDMS покрыта молекулы, адаптированной к интересам исследования. Рисунок 2 показывает каналы, покрытые флуоресцентной молекулой, PLL-г-PEG, до и после мытья (шаг 2.4). Такой эксперимент позволяет контролировать однородности покрытия в каналах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы опишем устройство состоит из микроканалов в качестве метода изучения миграционных свойств большого количества клеток в отдельных экспериментах. Эта экспериментальная система имитирует замкнутые экологические ограничения, найденные в тканях эндогенными перелетных клеток. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254