Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска по разработке модели мышей от рака молочной железы Метастазы в головной мозг с последующим продольного МРТ

Резюме

Рак мозга метастазы модель груди мыши устанавливается с ультразвуковой визуализации наведением внутрисердечной инъекции MDA-MB231/Br-GFP клеток. Развитие мультифокальными внутричерепных метастазов была контролироваться продольно использованием высокого разрешения 9.4 T MRI.

Аннотация

Рак молочной железы метастазами в головной мозг, происходящие в 30% больных раком молочной железы на стадии IV, связано с высокой смертностью. Медиана выживаемости составляет всего 6 месяцев. Это важно иметь подходящие животные модели для имитации гемодинамики распространение метастатических клеток в клинической ситуации. Здесь мы представляем использование небольшого ультразвуковых животное, чтобы вести точную инъекцию мозга раковых клеток тропический груди в левый желудочек бестимусных голых мышей. Продольная МРТ используется для оценки внутричерепного инициирование и рост метастазов в головной мозг. Ультразвуковая руководствуясь внутрисердечное впрыска обеспечивает не только точное инъекции и настоящим более высокую успешную ставку, но и значительно снизилась смертность, по сравнению с нашей предыдущей ручной процедуре. В естественных условиях с высоким разрешением МРТ позволяет визуализировать гиперинтенсивным мультифокальными поражений, как малые, как 310 мкм в диаметре на Т _{2-взвешенных} изображениях на 3 недели после инъекции. Фоллож-до МРТ показывает внутричерепное рост опухоли и увеличение количества метастазов, которые распространяют по всей мозга.

Введение

Мозг метастазы является наиболее распространенным внутричерепное злокачественных опухолей у взрослых. Прогноз крайне бедных, при медиане выживаемости 4-6 месяцев даже с агрессивного лечения. Рак молочной железы является одним из трех основных первичных раковых заболеваний с высокой заболеваемостью метастаза мозга ^1-3. Несколько линий рака молочной железы мозга Тропик способны развивать метастазы мозга после внутрисердечной или intracarotid инъекции ^4. Прямой впрыск опухолевых клеток в левый желудочек может обойти капиллярное русло легких и тем самым увеличить частоту формирования метастазов в головном мозге при минимизации висцеральные метастазы. MDA-MB231Br линия является одним из наиболее широко используемых человека линий рака молочной железы по развитию мозга метастазы в моделях грызунов ^5,6.

Как и многие другие исследования ^4,7, мы провели ручную процедуру инъекции внутрисердечной в наших предыдущих исследованиях. Тем не менее, только 50% успеха ставка была получена с руководствомвпрыска и доля мышей умерли от повторных инвазивных процедур, если предыдущие испытания не удалось. Здесь мы представляем использование процедуры обработки изображений наведением, чтобы закрепить инъекцию мозга ищущих раковых клеток молочной железы в левый желудочек бестимусных мышей. Продольная высокое разрешение МРТ применяется следовать внутричерепное развитие метастазов в головной мозг.

протокол

Все животные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Техаса Юго-западного медицинского центра.

1. Подготовка клеток MDA-MB231/Br-GFP

1. Получить и культура клеток MDA-MB231/Br-GFP (любезно предоставленные доктором. Пальмиери и Steeg, NCI) в DMEM среде, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина.
2. Соблюдайте состояние клеток и цвет среде, и заменить среднего каждые 2-3 дня.
3. Trypsinize и сбора клеток при 80% слияния будет достигнута, как описано в пунктах 1.3.1-1.3.5:
   1. Удалите старый среду полностью и добавить 5 мл PBS (1x), чтобы промыть клетки мягко. Снимите PBS от блюда.
   2. Добавить 1,5 мл трипсина в блюдо; наклонить блюдо осторожно, чтобы гарантировать, что все клетки покрыты трипсина. Поставьте блюдо обратно в камеру инкубатора и держать его при 37 ° С в течение 1 мин.
   3. Возьмите блюдо из инкубатора и наблюдатьклетки под оптическим микроскопом для обеспечения клетки отделяются от блюда.
   4. Добавить 3 мл среды прекратить действие трипсина. Сбор смеси клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга смеси при 2000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
   5. Осторожно снимите среду и не ресуспендирования клеток в 5 мл бессывороточной среде до получения однородной консистенции.
4. Всего соответствующее количество клеток и ресуспендируют их в бессывороточной DMEM среде с конечной концентрации 1,75 × 10 ⁵ клеток в 100 мкл объем.
   1. Возьмите 50 смесь мкл клеток и добавить 50 мкл трипанового синего. После смешивания, взять 10 мкл смеси и тщательно добавить в счетной ячейки слайда. Используйте несколько образцов, чтобы обеспечить точную оценку номер ячейки.
   2. Придерживайтесь в счетной ячейки горкой, одного конца в то время, и клеточной счетчик начинает отсчет автоматически. Возьмите среднее значение всех результатов подсчета и расчета общего количества клеток.
   3. Центрифуга клетки снова и ресуспендируют их вСоответствующий объем бессывороточной среде, приведет к конечной концентрации 1,75 × 10 ⁵ клеток/100 мкл объем.
5. Место клетки на льду до внутрисердечной инъекции.

2. Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска

1. Используйте Обнаженная мышей (BALB / с ню / ню) между 6-8 недель.
2. Войти в систему визуализации. Инициализация датчика 704 (40 МГц).
3. Начните новое исследование и заполните информацию.
4. Обезболить (3% isoflurane/100% О ₂ в индукционной камере) и поддерживать животных изофлураном (2%) в 100% O ₂ (1 дм ³ / мин) в течение всей процедуры через носовой обтекатель. Анестезия подтверждается, когда нет вывода рефлекс не наблюдается с ног крайнем случае.
5. Установите температуру таблицы изображений до 37 ° C. Лента наркозом мышь к столу с подогревом изображений в положении лежа на спине.
6. Держите ультразвуковой гель при 37 ° С до имстарения. Нанесите гель на грудь мыши.
7. Установите датчик в держатель. Опустите датчик до достижения требуемой глубины изображения. Перемещение на сцену, пока левый желудочек не отождествляется с восходящей аорты как ориентир (рис. 1А). Зафиксируйте этап, когда четкое представление о левого желудочка визуализируется.
8. Нарисуйте 100 мкл смеси клеток в 1 мл шприц с 22 G иглы. Место и закрепите шприц на шприц монтировать.
9. Перемещение шприц вперед к груди мыши и тщательно перемещать его из стороны в сторону, пока кончик иглы не находится в поле изображения зрения (перед входом мышь).
10. Отрегулируйте высоту иглы и угол, чтобы прицелиться вниз в левый желудочек.
11. Проникнуть иглу шприца в межприбрежного пространства незамедлительно через кожу и мышечные слои в левый желудочек под руководством ультразвуковой визуализации.
    Указание успешного введении иглы в левую VentriНКУ является рефлюкс свежего артериальной крови (розового цвета в отличие от темно-красного венозной крови) в шприц
12. Введите смеси клеток медленно (рис. 1В).
13. После завершения, извлеките иглу, поднимите преобразователь, очистить ультразвуковой гель с влажной марлей и удалить ленту.
14. Подготовьте чистую клетку с разогретой площадку.
15. Место животное на площадку и наблюдать животное до полного выздоровления.
16. Контролировать поведение животного каждые 24 ч в течение двух дней.
17. Мониторинг Общие условия и неврологические признаки осложнений в подопытных мышей регулярно.

3. МРТ Мониторинг внутричерепного развития опухоли

1. Используйте 9,4 Тесла магнит для мониторинга внутричерепного развитие метастазов в головной мозг.
2. Инициировать МРТ через две недели после имплантации опухоли и повторить один раз в неделю на срок до трех недель.
3. Степенный животных с 3% изофлуран и поддерживать их под генаRAL анестезии (1,5% изофлуран).
4. Контролировать и поддерживать температуру тела животных и постоянную дыхания в течение всего эксперимента.
5. Высокое разрешение мультиспиральной (14 ломтики с толщиной 1 мм, без зазора) Т ₁ - и Т _{2-взвешенный} корональные изображения, охватывающие область от лобной доли в задней черепной ямке, приобретаются со следующими параметрами: T _{1-взвешенных} изображениях: спинового эха несколько ломтик (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 мс, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм ^2. T _{2-взвешенных} изображениях: быстро спинового эха несколько ломтик (FSEMS) последовательностей, TR / TE = 2500 msec/48 мс, 8 эхо поезда, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм ^28,9.
   Опухолевые поражения появляются ярче, чем обычные тканях мозга на Т _{2-взвешенных} изображениях.
6. Размер опухоли определяется на Т _{2-взвешенных} изображениях вручную изложением enhanCing долю массы на каждом изображении с помощью MATLAB программы, написанные нами ^8.
   Учитывая большую часть опухоли диаметры меньше, чем толщина среза (1 мм), размер опухоли представлен как в плоскости области, а не объема.

4. Н & E Окрашивание Подтверждение метастазов

1. Жертвоприношение мышей сразу после последнего MR сканирования, препарировать опухолями мозга и вставлять его в октябре среды и замораживали в -80 ° С
2. Раздел серия 10 мкм толщиной корональной мозга образцы с криостата.
3. Выполните H & E окрашивание на участках головного мозга.

Результаты

С высоким пространственным разрешением МРТ (78 мкм в резолюции плоскости), гиперинтенсивных повреждения могут быть определены как малые, как 310 мкм в диаметре (рис. 2). Так как метастазы в этом исследовании очень малы и развитие некроза и отека минимальна, гиперинтенсивным пораже...

Обсуждение

В настоящем исследовании мы показали, что ультразвуковое исследование наведением впрыска левого желудочка обеспечивает точность, так что наблюдалось каждое животное в данном исследовании разработана метастазами в головной мозг и ни одно животное смерть. Красота изображений наведен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583