Щелочно-сжечь травмы Модель неоваскуляризации роговицы у мышей

Неоваскуляризация (Невада) роговицы может осложнить несколько визуальных патологий. Используя контролируемое, модель щелочно-ожога количественному уровень роговицы NV могут быть произведены для механистической изучения роговицы NV и оценки потенциальных методов лечения для неоваскулярных расстройств.

Аннотация

В нормальных условиях, роговица аваскулярный, и эта прозрачность имеет важное значение для поддержания хорошего остроту зрения. Неоваскуляризация (Невада) роговицы, которое может быть вызвано травмой, кератопластики или инфекционного заболевания, ломается так называемый 'ангиогенную привилегией »роговицы и составляет основу нескольких визуальных патологий, которые могут даже привести к слепоте. Хотя есть несколько вариантов лечения, фундаментальная медицинская потребность представлен роговицы неоваскулярных патологий остается неудовлетворенным. В целях развития безопасных, эффективных и целенаправленных методов лечения, надежная модель роговицы NV и фармакологического вмешательства не требуется. Здесь мы описываем возможность получения травмы щелочно-ожог роговицы модель неоваскуляризации в мыши. Этот протокол предусматривает способ применения контролируемой щелочно-ожоговой травмы роговицы, введения фармакологического соединение, представляющее интерес, и визуализации результата. Этот метод может оказаться инструментальныхТаль для изучения механизмов и возможностей для вмешательства в роговицы NV и других неоваскулярных расстройств.

Введение

Роговицы слепота является четвертым наиболее распространенной причиной слепоты, причиной примерно 4% всех случаев ^1. Неоваскуляризации роговицы (Невада) играет значительную роль во многих из этих патологий, в том числе герпетического кератита (основной инфекционной причиной слепоты на Западе) и трахомы (ведущей причиной инфекционного слепоты во всем мире) ^2. Современные методы терапии включают стероиды, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), анти-VEGF терапии, и циклоспорин А, а также обычные или лазерные хирургические методы ^3. Тем не менее, серьезно изнурительных характер роговицы NV основана патологий, малочисленность хирургического оборудования, способных лечить роговицы NV, а также отсутствие сильно выполняющего фармакологической вариант привел недавний экспертный круглый стол на заключение, что, несмотря на дошедших до нас терапии, фундаментальную медицинскую потребность представленный этих патологий остается неудовлетворенным ^4.

Роговицы человекасостоит из 5 слоев, 3 клеточных слоев (эпителиальные, стромальные и эндотелия) и 2 интерфейса (Bowman мембраны и десцеметовой мембраны). Он функционирует как механический барьер и преломляющей поверхности для глаз. Его прозрачный характер является следствием тонкий баланс его компонентов и является неотъемлемой частью его нормального функционирования ^5. Обычно бессосудистый, роговица получает кровь из микрососудов, проходящую вдоль его внешней кромке, которые питаются от ресничного и глазных артерий. Роговицы NV происходит, когда стимул способствует ангиогенез этих сосудов, позволяя им расти по направлению к центру роговицы и таким образом ограничить видение ^6. Роговицы ангиогенез включает hemangiogenesis и лимфангиогенез, которые приводят к врастанию сосудов и лимфатических сосудов от лимба сосудистой аркады к центру роговицы. Это приводит к нарушению роговицы "ангиогенной привилегии», увеличение помутнения роговицы и фиброза, нарушения роговицы лаYers и отек ^7. Точные триггеры роговицы NV многочисленны, начиная от ответа на инфекционное заболевание, например, трахомы к химически индуцированного государства вызвало народной медицины, промышленные химикаты, или даже боевых отравляющих веществ.

Молекулярные механизмы этого процесса нет, пока еще, полностью охарактеризованы; однако, несколько ключевых игроков были определены. При нормальных условиях роговица обладает уникальным 'ангиогенную привилегию' поддерживается избыточный массив антиангиогенных факторов (таких, как растворимого VEGF-R1) ^8. Тем не менее, в ответ на внешний раздражитель (например, травмы), будет местный регуляция проангиогенных факторов (например, VEGF-A). Это советы баланс про и анти-ангиогенных факторов лежит в основе ангиогенную привилегию роговицы, и приводит к hemangiogenesis, lymphangeogenesis и воспаление, поэтому вызывает роговицы патологии и даже слепоту ^9.

<р = класса "jove_content"> Учитывая неудовлетворенная медицинская потребность этого весьма изнурительной патологии, он представляет интерес для области, чтобы иметь надежный животную модель роговицы NV. Здесь мы представляем такую модель: контролируемое повреждение щелочно-ожога. Различные модели глаз травмы на основе с использованием фильтровальной бумаги кольца были использованы с 1970-х годов ^10. В 1989 году группа из Гарвардской медицинской школы офтальмологов характеризуется стандартную модель центрального повреждением роговицы щелочно-ожоговой в кролика на основе замачивания кусок круглой фильтровальной бумаги с гидроксидом натрия (NaOH) и применяя его к роговице в определенном диапазоне концентрации ^11. С тех пор эта техника была адаптирована для использования в ^12-14 мыши. В последнее время лаборатория Ван изучал терапевтические эффекты гистондеацетилазы (HDAC) ингибитора САХА в патогенезе роговицы NV с помощью мыши роговицы щелочно-ожогов модель ^15. Методология мыши роговицы щелочно-ожоговой травмы модели, представленной здесь был построенв основном на предварительной работе двух других работах ^14,16.

протокол

Примечание: Следующий протокол и представительные результаты использовать HDAC ингибитор Саха качестве примера соединения. Тем не менее, этот протокол является отнюдь не ограничивается к использованию САХА, и рекомендуется в качестве общего метода для проверки влияния растворимых соединений на неоваскуляризации роговицы. Незначительные изменения должны быть сделаны для степени разбавления, а также частоты и длительности применения. Кроме того, соединения, которые легко растворимы в воде смогут быть введены в отсутствие ДМСО.

Этические Заявление: Все эксперименты на животных должны выполняться только в соответствии с национальным законодательством и институциональных правил. Этот протокол был одобрен для использования университета Tulane Уходу за животными и использованию комитета.

1. Подготовка материалов (в порядке использования)

Отрежьте кусок целлюлозы фильтровальную бумагу (11 мкм) на 2 мм кругах.
Подготовка 1 М раствора NaOH порастворения 20 г NaOH в 500 мл дистиллированной H ₂ O. Хранить при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: решения NaOH вызывают коррозию и может привести к щелочно-ожоги.
Подготовка обезболивающий коктейль разбавлением 10 мл 100 мг / мл кетамина и 2,5 мл 20 мг / мл ксилазина в 37,5 мл 1х PBS до конечной концентрации 20 мг / мл кетамина и 4 мг / мл ксилазина.
Приготовьте 0,5%-ный раствор гидрохлорида пропаракаина (для местного обезболивания) растворением 500 мг гидрохлорида пропаракаина в 100 мл отфильтрованной PBS.
Приготовьте 1х PBS растворением 8 г NaCl, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г Na ₂ HPO _{4 и} 0,23 г NaH ₂ PO ₄ в 900 мл дистиллированной H ₂ O. Отрегулируйте до 7,4 рН. Доведите раствор до конечного объема 1000 мл дистиллированной H ₂ O и фильтруют для обеспечения стерильности.
Подготовка 1000 х исходные растворы SAHA при ~ 100 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО) растворением 26,4 мг SAHA в 1 мл ДМСО. Развести в 1х (~ 10 мкМ)Раствор фильтруют в PBS для каждого использования. Храните маточного раствора при температуре -20 ° С в течение до одного месяца. ВНИМАНИЕ: ДМСО является известный токсин и мутагенным.
Подготовка 4%-ный раствор параформальдегида (PFA) для фиксации. В соответствии с химическим капотом, растворить 4 г PFA в 90 мл PBS. Доведите смесь до 65 ° С и титруют до рН 7,4. После того, как PFA не растворится, довести раствор до конечного объема 100 мл. Хранить при температуре 4 ° С в течение до одного месяца. ВНИМАНИЕ: PFA является, как известно, аллергенным, канцерогенным и токсичным.
Приготовьте 1х блокирующий буфер разбавлением 5 мл козьей сывороткой и 500 мкл Тритона Х-100 в 94,5 мл PBS.
Приготовьте 1х промывочный буфер при разбавлении 500 мкл Тритона Х-100 в 99,5 мл PBS.

2. Щелочно-ожогов и обработки соединением

Замачивание круглый кусочек фильтровальной бумаги, ~ 2 мм в диаметре, в растворе 1 М NaOH.
Обезболить мышь с инъекцией 100 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина, белыйич составляет ~ 100 мкл анестетика коктейль с этапа 1.3 в 25 г мыши. Анестезия займет ~ 1-2 минут, чтобы установить дюйма Глубина анестезии может определяться мягко зажимая палец или хвост животного, если анестезия достаточно не должно быть никакого ответа. Примечание: Следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать мышь не поддаваться анестезии индуцированной гипотермии.
Использование пипетку, местно применять капли гидрохлорида пропаракаина 0,5% до поверхности роговицы для местного обезболивания.
Использование стерильного пинцета, забрать кусок NaOH, смоченной фильтровальной бумаги. Если вы заметили избыток NaOH цепляясь или капает из фильтровальной бумаги, коротко нажмите на смоченную фильтровальную бумагу на сухую кусочек фильтровальной бумаги, чтобы поглотить избыток. Поместите кусок NAOH, смоченной фильтровальной бумаги на центральной роговицы. Оставьте его в течение 30 сек для создания острый щелочного-ожог ~ 2 х 2 мм ² в области. Операционный микроскоп является полезным в правильно размещения фильтровальную бумагу. Примечание: только один глаз от мыши сhould получить травму с другой выступающей в качестве контроля.
Удалить фильтровальную бумагу. Использование 10 мл шприц, осторожно промойте глаз 10 мл 1x PBS дважды, чтобы смыть остаточной 1 М NaOH.
Сразу нанесите каплю 1x САХА рабочего раствора (или управления транспортным средством, состоящий из PBS разбавляют ДМСО, не содержащий Саха) местно на роговицу. Повторите приложений 3 раза в день в течение 14 дней. Примечание: в этот период мази антибиотик не рекомендуется, поскольку это может помешать развитию травмы и доставки соединения. Использование жидкого раствора к антибиотикам, такие как 3%-ный раствор гентамицина, вместо этого.
Перейдем непосредственно к клинической оценке (Протокол 3 ниже) или пожертвовать мышь и выяснять глаза для роговицы плоской горы (протокол 4 ниже) или обычный парафин / замороженные гистология.

3. Клиническая оценка

Выполните ежедневный осмотр мышей слепым под операционным микроскопом и оценка грorneal Н.В. на основе помутнения роговицы, NV, и размера судна. Используйте как минимум двух наблюдателей и записать окончательный счет, который в среднем из двух.
1. Оценка помутнение роговицы на шкале 0-4. 0 = полностью прозрачные; 1 = слегка мутной, радужной оболочки и зрачка хорошую видимость; 2 = немного непрозрачные, радужной оболочки и зрачка еще обнаружить; 3 = непрозрачные, ученики вряд ли обнаружению; и 4 = полностью непрозрачные без вида ученика.
2. Оценка NV на шкале 0-3. 0 = нет новых сосудов; 1 = новых сосудов в роговицы лимба; 2 = новых сосудов, охватывающих роговицы лимб и приближающиеся роговицы центр; 3 = новых сосудов, охватывающих роговицы центр.
3. Оценка размера судна в масштабе 0:3. 0 = нет новых сосудов; 1 = новых сосудов обнаруживаемые под операционным микроскопом; 2 = новых сосудов легко видеть под операционным микроскопом; 3 = новых сосудов легко видеть без микроскопа.
Использование цифровой камеры, взять репрезентативные изображения глаза на 7 дней и 14 дней.

4.Роговицы Окрашивание и плоские крепления

Fix энуклеированные глаз в 4% PFA в течение не менее 1 часа при 4 ° С.
Перенести глаза на 1x PBS и использовать пинцет, чтобы тщательно удалить излишки ткани.
С помощью операционного микроскопа, использовать иглу (18 калибра) или микро-нож перфорировать pericorneal область глаза (обратите внимание: это должно выпустить жидкость из глаз).
1. С перфорацией, достигнутом в разделе 4.3.1 использовать пару хирургических ножниц вырезать переднюю часть глаза (роговицы) из задней части.
Трансфер роговицы обратно в 4% PFA для фиксации в течение ночи при 4 ° С.
Откажитесь от 4% PFA (ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть утилизированы в соответствии с институциональными нормами) и промыть роговице три раза 1x PBS, чтобы удалить остатки PFA.
Инкубировать в 1x блокирующем буфере в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре к проницаемыми ткани и предотвращения неспецифического связывания из первичного антитела.
1. Применение первичного антитела в блокирующем буфере 1x, при 100-500 кратного разведения. (Например, крыса анти-мышь-РЕСАМ-1 для обнаружения кровеносные сосуды в 1:100, кроличье анти-мышь-LYVE-1 для обнаружения лимфатические сосуды в 1:500 и / или крыса anti-mouse-F4/80 для обнаружения макрофаги 1:100). Инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
2. Промыть шесть раз промывочным буфером 1X в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре, чтобы полностью удаления несвязанного первичного антитела.
3. Нанесите вторичного антитела в 1x блокирующего буфера на 500-1000 кратного разведения. (Например, 488 нм флуоресцентный отмеченных козьего антитела против крысиного IgG-на 1:800 или 594 нм флуоресцентный отмеченных козьего анти-кроличьего IgG-на 1:800). Инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
4. Промыть три раза 1x PBS в течение 1 часа каждого при комнатной температуре в полной мере удаления несвязанного вторичного антитела.
Передача роговицы в свежую 1x PBS, и с помощью операционного микроскопа, тщательно делают надрезы четыре от периферии к процентаэ. Это должно разделить роговицу на четыре квадранта приблизительно равные (в результате форма должна выглядеть скорее как бабочка) и дайте ему лежать на слайде.
Установите с монтажным среде, подходящей для флуоресцентных изображений. Для достижения наилучших результатов, образцы должны быть отображены сразу и цифровые фотографии, сделанные, но может храниться в течение нескольких недель в защищенном от света при температуре 4 ° C.

Результаты

После травмы щелочно-ожоговой, роговицы Н.В. происходит в предсказуемой, зависящим от времени образом. Рисунок 1 демонстрирует суровую разницу как в новых сосудов и помутнения роговицы между необработанной животного (рис. 1А) и животного, обработанного HDAC ингибитором ?...

Обсуждение

Протокол, представленные здесь приводит к воспроизводимых уровней hemangiogenesis, лимфангиогенеза и воспаление, что делает его идеальной системой для изучения этих трех (взаимосвязанных) процессов. Хотя этот метод производит централизованную роговицы Н.В., несколько методов, которые были р?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны за помощь доктора Xinyu Ли в подготовке рукописи. З поддержали Startup фонда Тулэйн университета, президента исследовательского совета Нью-следователь премии от UT Юго-западного медицинского центра, NIH Грант EY021862, премию развития карьеры от исследований в области профилактики слепоты основу, и на премию Яркий Фокус в возрастная дегенерация желтого пятна исследований .

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD	309659
18 G Needle	BD	305918
10 ml Syringe	BD	306575
25 G Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH₂PO₄	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20