JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.

Аннотация

Покадровой обработки изображений является метод, который позволяет для прямого наблюдения процесса формообразования, или генерация формы. Благодаря своей оптической прозрачности и аменабельности к генетической манипуляции, данио эмбрионов стал популярным модельным организмом, с которой для выполнения покадровой анализ формообразования в живых эмбрионов. Конфокальной визуализации живого данио эмбриона требует, чтобы ткань интерес упорно метили флуоресцентным маркером, таким как трансгена или вводили краситель. Процесс требует, чтобы эмбрион находится под наркозом и удерживается на месте таким образом, что здоровое развитие протекает нормально. Параметры для визуализации необходимо установить для учета для трехмерного роста и сбалансировать требования решении отдельных клеток при получении быстрые снимки развития. Наши результаты демонстрируют способность выполнять долгосрочный в естественных изображений флуоресцентных меченных эмбрионов данио и обнаруживать различные поведения тканей вчерепная нервного гребня, которые вызывают черепно-лицевые аномалии. Развивающие задержки, вызванные анестезией и монтажа минимальны, и эмбрионы невредимым процессом. Покадровый отображаемого эмбрионы могут быть возвращены в жидкой среде, а затем отображены или фиксированной на более поздних точек в развитии. С увеличением обилия трансгенных данио линий и хорошо характеризуется отображением судьбы и методов трансплантации, визуализации любого желаемого ткани можно. Таким образом, покадровой в естественных изображений сочетает мощно с данио генетических методов, в том числе анализа мутантных и микроинъекции эмбрионы.

Введение

Черепно-лицевой морфогенез является сложным многоэтапным процессом, который требует скоординированных взаимодействий между несколькими типами клеток. Большинство черепно-скелета происходит от клеток нервного гребня, многие из которых должен мигрировать из дорсальной части нервной трубки в переходных структурах, называемых глоточных арки 1. Как и во многих тканях, морфогенез черепно-лицевой скелет является более сложным, чем можно понять, статических изображений эмбрионов в конкретных развития времени. Хотя это занимает много времени для выполнения, в естественных условиях покадровой микроскопии обеспечивает непрерывный взгляд на клетки развивающегося эмбриона и тканей. Каждое изображение в серии покадровой придает контекст с другими, и помогает следователь движение к выведению почему явление происходит, а не выводя то, что происходит в это время.

В естественных изображений, таким образом, мощным описательный инструмент для экспериментальных подходов кдеконструировать пути, которые ведут морфогенез. Данио рерио Данио является популярным генетическая модель позвоночных эмбрионального развития, и особенно хорошо подходит для работы с изображениями в естественных морфогенеза. Современные, удобные методы трансгенеза и геномной модификации быстро развиваются количество инструментов, доступных для рыбок данио исследователей. Эти инструменты повышения уже надежные методы для генетических манипуляций и микроскопии. В естественных изображений практически любого ткани практически в любой желаемой генетической контексте ближе к реальности, чем фантазии.

Морфогенетические движения фарингеальных дуг руководствуются взаимодействия между нервного гребня и прилегающей эпителия, как эктодермы и энтодермы сигнализации. Есть множество сигнальных молекул, выраженные эпителия, которые необходимы для управления морфогенез черепно-лицевых скелетных элементов. Среди этих сигнальных молекул, Еж Соник (Тсс) является критически важным еили черепно-лицевого развития 2-8. Тсс выражается как в устной эктодермы и глотки энтодермы 2,6,9,10. Экспрессия Shh в энтодерме регулирует морфогенетические движения арок 10, структурирование нервного гребня в арках 10, и роста черепно-лицевой скелет 11.

Сигнализации Bmp также критически важно для черепно-лицевого развития 12 и может изменить морфогенез фарингеальных дуг. Сигнализации Bmp регулирует спинной / вентральной паттерна гребня внутри фарингеальных дуг 13,14. Срыв smad5 у рыбок данио вызывает серьезные дефекты небные и отказ хрящей в Меккеля на предохранитель соответствующим по срединной линии 15. Кроме того, мутанты также отображать сокращения и слияния в вентральной элементов хряща, с 2-го, 3-го, а иногда и 4-й глотки арки элементов, слитых на средней линии 15. Эти гибриды настоятельно рекомендую, что передача сигналов Bmp направляет морфогенез этих глотки элементов.

Сигнализации PDGF необходимо для черепно-лицевого развития, но имеет неизвестные роли в глотки арки формообразования. Оба мышей и рыбок данио мутанты PDGFRA имеют глубокое средней зоны лица clefting 16-18. По крайней мере, у рыбок данио это средней зоны лица clefting является из-за сбоя надлежащего миграции клеток нервного гребня 16. Клетки нервного гребня продолжают выражать PDGFRA после того как они вошли в глотки арки. Кроме того, PDGF лиганды выражаются лица эпителия и в фарингеальных дуг 16,19,20, таким образом сигнализации PDGF может также играть роль в морфогенезе фарингеальных дуг следующих миграции. Тем не менее, анализ морфогенеза фарингеальных дуг в PDGFRA мутантов не были выполнены.

Здесь мы демонстрируем в естественных условиях конфокальной микроскопии pharyngulстадии трансгенных данио и описать морфогенез фарингеальных дуг в течение этого периода. Мы также продемонстрировать, ткани поведения, которые страдают от мутаций, которые нарушают BMP, PDGF и Тсс сигнальные пути.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Животноводство и мутантных аллелей

  1. Поднимите и породы данио, как описано 21.
  2. Данио рерио мутантные аллели, используемые в этом исследовании, были PDGFRA b1059 16, smad5 B1100 22, и SMO B577 23. Источники для этих рыбок данио штаммов включают Zirc.

2. Приготовление растворов и реализует

Примечание: Все решения и реализует можно сделать заранее и хранить для будущего использования.

  1. Сделать эмбриона СМИ (EM), как описано выше 21.
  2. Сделать 4 г / л MS-222 (Tricaine). Растворите 4 г динатрийфосфат (Na 2 HPO 4) в 450 мл стерильной воды. Добавить 2 г MS-222 в растворе. Отрегулируйте рН до 7,0-7,2 в. Добавить стерильную воду до общего объема 500 мл.
  3. Дополнительно: Сделайте 4 г / л гвоздичное масло. Взвесьте 0,2 г чистого гвоздичное масло в 50 мл коническую трубку. Добавить EM до общего объема 50 мл. Хранить при 4 ° С.
  4. Сделать 3% methylcelluloсебе. Принесите 50 мл ЭМ + 0,1 М HEPES до кипения. Снять с огня. Движение в 1,5 г метилцеллюлозы, пока раствор не является однородным. Хранить при 4 ° С.
  5. Сделать 0,2% агарозы. Добавить 0,1 г агарозы до 50 мл ЭМ. Bring Em до кипения в микроволновой печи или на плите и убедитесь, что агарозы растворится. Алиготе в 500 мкл объемы в микропробирок и хранить при 4 ° С. Примечание: Объемы можно регулировать по мере необходимости.
  6. Сделать капиллярные кочерги. Поместите каплю супер клей внутри 0,9 мм ID капиллярной трубки. Вставка 4-5 см длиной 6 фунтов тестовой мононити лески внутри капиллярной трубки так, что примерно 3-4 мм от линии выходит за пределы конца трубки.
  7. Сделайте два мостиком покровные на образце. Супер-клей 22 х 22-1 защитное стекло на каждом конце 24 х 60-1 покровного стекла, оставляя средний бесплатно. Сделать синглов (1 небольшая крышка стекла в конце) для эмбрионов менее чем за один день старого, удваивает (2 маленьких покровные стекла в верхней части друг с другом в конце) для эмбрионов от одного до четырех гн я старый, или тройки (3 маленьких покровных стекол друг на друга за конец) для эмбрионов пять дней и старше.
  8. Наполните 10 мл шприц с высокой вакуумной смазки. Примечание: вакуумной смазки служит в качестве герметика, чтобы предотвратить дегидратацию образцов в течение длительных периодов времени, и имеет низкий потенциал токсичности по сравнению с более летучих герметиков.

3. Монтаж эмбрионов данио для конфокальной микроскопии (см. Рисунок 1)

  1. Подготовка обезболивающий среду. Растопить аликвоты 0,2% агарозы, не в микроволновой печи в течение 20-секундными интервалами до полного жидкость. Смешайте 8 мкл MS-222 в 192 мкл 0,2% агарозы или 5 мкл 4 г / л гвоздичного масла в 195 мкл 0,2% агарозы. Поддерживать в 42 ° C нагревательный блок. Примечание: Длительное воздействие MS-222 вызывает сильные задержки в развитии, чем гвоздичного масла делает в эмбриональном рыбок данио 24.
  2. При необходимости вручную dechorionate невылупившиеся трансгенные эмбрионы должны быть проанализированы непосредственно перед анализом. Использование щипцов, медленно тэар хориона открыта до эмбрион не освобождается.
  3. Обезболить эмбрионов рыбок данио. Добавить 1 мл 4 г / л запаса MS-222 в 24 мл эмбриона СМИ. Кроме того, добавить 390 мкл 4 г / л гвоздичного масла на 24 мл рыбного воды 24. Примечание: гвоздичное масло действует медленно, так выполнить этот шаг, по крайней мере 15-20 минут до покадровой микроскопии.
  4. Поместите шарик вакуумной смазки вокруг центрального пространства обращенной кверху мостовом покровное. Медленно вставьте вакуумную смазку из шприца, что делает плавный, непрерывный шарик, который примыкает к и внутри мостов и краю покровного стекла.
  5. Распространение круг 4% метилцеллюлозы в середине мостикового покровное с помощью деревянного аппликатора.
  6. Трансфер эмбрион перед созданием образа. Когда эмбрион находится под наркозом сделать его в стеклянную пипетку. Удерживая пипетку вертикально, чтобы позволить эмбрион опускаться на дно жидкости в пипетку. Перемещение пипетки в раствор агарозы и позволяют эмбрион падатьв агарозы. Не выдавить жидкость.
  7. Поместите образец. Нарисуйте какое-то решение агарозном и эмбрион в пипетку. Извергните эмбриона в капле раствор агарозы в верхней части метилцеллюлозы. Используйте капилляров в покер, чтобы подтолкнуть эмбрион вниз на метилцеллюлозы и ориентировать эмбрион как нужный для работы с изображениями.
  8. Печать образца.
    1. Поместите один мостовой покровное на вершине смонтированном один, лицом вниз. Прикладывая усилия к обеим сторонам, зажатых покровные пока мосты не прямой контакт и агарозные падение уплотнения к обеим покровные. Убедитесь, что эмбрион в правильной ориентации.
    2. Натрите деревянный аппликатор вдоль стекла, чтобы сгладить трещины и зазоры в вакуумной смазки шарик. Вытрите лишний жир от краев.

4. Покадровый конфокальной микроскопии трансгенных эмбрионов рыбок данио

(Этот протокол был оптимизирован для Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии насING обработки изображений ZEN, и может быть модифицирована для использования с другими системами.)

  1. Активируйте оборудования. Включите конфокальной микроскопии и любых внешних лазерных устройств. Включите компьютер, подключенный к конфокальной микроскопии. ПО для обработки изображений Открыть конфокальной и выберите "Start System" активизации параметров захвата изображений.
  2. Подготовка подогревом этап. Опустите промежуточной платформы конфокальной микроскопии и двигаться объективные линзы из положения. Заменить этап по умолчанию с электронным подогревом этапе. Включите контроллер для нагретого сцену и установить температуру для 29,5 ° С.
  3. Расположите образец в поле зрения. Поместите установленные образца на сцене. Перемещение объектива 20X в положение и поднять промежуточную платформу. Активируйте видимого света излучатель и смотреть через окуляры. Глава центра эмбриона в поле зрения.
  4. Определение настроек эксперимента.
    1. Активируйте флуоресценции каналов, выбравдлина волны флуоресценции для обнаружения и выбрать цвет таблицы поиска (LUT) для каждого канала. Если необходимо, используйте ручное управление в программном обеспечении, чтобы включить необходимых лазеров (например, 561 нм для RFP). Для каждого флуоресценции канала, нужно задать интенсивность лазера на 10,0 и ФЭУ напряжения (HV или усиления) между 600-700. Установите усреднение до 4 и битовую глубину до 16 бит.
    2. Активируйте модулей серии Z-Stack и времени. Установите крошечное отверстие для Z-разрешением 5 мкм или меньше, и установить Z-интервал до предложенного оптимальном расстоянии.
      Примечание: Как правило, 5 Z-разрешение мкм позволяет каждому Z-Stack изображения должны быть собраны достаточно быстро для «моментальный снимок» эмбриона в определенный момент времени в то же время решения отдельных клеток. Понижение усреднение также уменьшает количество времени на изображении.
    3. Определите желаемый временной интервал между изображениями (обычно 10-20 мин) и общую длину эксперимента.
  5. Установите позиционныйинформация.
    1. Включите камеру, чтобы режиме реального времени. Отрегулируйте фокус и увеличить интенсивность лазера при необходимости, чтобы увидеть флуоресценцию. Установите цифровой зум до 0,6 для более широкого зрения, если это необходимо.
    2. Расположите этап таким образом, чтобы все структуры интереса видны и есть место в поле зрения для вырост спинной и кпереди. Фокус через эмбриона к верхним и нижним пределами флуоресценции. Установите первую и последнюю позиции Z-Stack ломтик не менее 100 мкм или более за эти пределы.
  6. Оптимизация интенсивности флуоресценции.
    1. Установите дисплей LUT в диапазоне индикатор. Сейчас Люминесцентные структуры должны появиться белые, а остальные поля зрения должен быть синего цвета (нет обнаружения) или черный.
    2. Увеличение HV / прибыль до уровня чуть ниже, где насыщенный появляются (красный) пикселей. Если необходимо, отрегулируйте смещение так большинство фоне не обнаруживается (синий). Примечание: Меньше диаметр микроотверстий и повышенную интенсивность лазера и улучшить изображения ЗащитуInition, но интенсивность лазерного должна быть низкой, чтобы сохранить живые ткани. Увеличение ВН / усиления и отверстие диаметром (<5 мкм), как правило, предпочтительнее повышенной интенсивности лазерного.
    3. Держите диаметр микроотверстий достаточно широким, чтобы собирать изображения своевременно, в среднем наборы до 4. Z-интервал всегда должен быть установлен в предложенной оптимального расстояния для диаметр микроотверстий. Выполните короткие сканирования (в среднем = 1) с различными настройками, и использовать минимальную интенсивность лазерного который достигает нужного разрешения.
  7. Запуск эксперимент для желаемого периода времени. После этого удалить эмбрион от нагретого стадии и медленно отделить покровные. Погрузите покровное и зародыш в EM в 30 мм чашки Петри. Используя стеклянную пипетку осторожно мыть эмбрион прочь покровного стекла и снимите покровное от чашки Петри. Поместите эмбрион в 28.5 ° C инкубатора продолжать развивать.
  8. Сравнение роста. В конце эксперимента, принимать индивидуальную Zsгалс изображения агарозных монтажа эмбрионов, которые были родственных аналогичным образом, организованных в образце в начале эксперимента, но были подняты в EM в инкубаторе 28,5 ° C.
  9. Измерьте глотки арки, по мере необходимости. Измерения можно проводить в некоторых конфокальной программные комплексы. Измерения, найденные здесь, были выполнены с использованием Fiji25 путем импорта и Z-проектирования. LSM файлы отдельных кадров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В эмбрионов дикого типа, после нервной населения гребня, глоточные арки удлиненные вдоль передней / задней и спинной / вентральной осей при движении в ростральном направлении (Movie 1). В 30 часов после оплодотворения (ФВЧ), длина передней / задней первого глотки арки между 1,8-1,9 раза ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Покадровый конфокальной микроскопии является мощным инструментом для анализа развития. Здесь мы демонстрируем полезность метода в изучении глотки арки морфогенез у рыбок данио, которые мутант для важных сигнальных использованием трансгенных что помечает клетки нервного гребня. В д?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим Мелисса Гриффин и Дженна Rozacky для их квалифицированного ухода рыбы. ДПМ благодаря EGN для написания помощь, щедрость и терпение. Эта работа была поддержана NIH / NIDCR R01DE020884 чтобы JKE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6 lb Test monofilament lineCortland Line CompanySLB16
Agarose IAmresco0710
Argon laserLASOS Lasertechnik GmbHLGN 3001
Calcium chlorideSigma-AldrichC8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm IDFHC30-31-0
Clove oilHilltech Canada, Inc.HB-102
High vacuum greaseDow Corning2021846-0807
Isotemp dry-bath incubatorFisher Scientific2050FS
Laser scanning microscopeCarl Zeiss AGLSM 710
Magnesium sulfate hexahydrateSigma-Aldrich230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1Fisher Scientific12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1Fisher Scientific12-545-M
Potassium chlorideFisher ScientificM-11321
Potassium phosphate dibasicSigma-AldrichP3786
Sodium chlorideFisher ScientificM-11624
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS7907
TempController 2000-2PeCon GmbH
Tricaine-SWestern Chemical, Inc.

Ссылки

  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  3. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
  5. Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
  7. Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
  8. Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3(1996).
  9. Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
  10. Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
  11. Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
  12. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
  13. Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
  14. Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
  15. Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
  16. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
  17. Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
  18. Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
  19. Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
  20. Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
  22. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533(2013).
  23. Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
  24. Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  26. Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

83

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены