Визуализация G3BP стресс Гранулы Dynamics в живых первичных клеток

Резюме

Стресс гранулы (SGS) являются цитоплазматические гранулы РНК, содержащие зашедших в тупик частицы рибонуклеопротеин (мяРНП), и важно в клеточного ответа на различных стрессов. Динамика ИК может следовать в живых клетках, визуализируя локализацию помеченной составляющей ИК в трансфектированных первичных клеток после стресса.

Аннотация

SGs могут быть визуализированы в клетках иммунным окрашиванием конкретных белковых компонентов или полиА + мРНК. SGs очень динамичны и изучение их собраний и судьбы Важно понимать, клеточный ответ на стресс. Дефицит в ключевых факторов ПГ как G3BP (домен связывающий белок RasGAP SH3) приводит к дефектам развития у мышей и изменениями центральной нервной системы. Для изучения динамики ИК в клетках из организма, можно культуры первичных клеток и следуйте локализацию трансфицированной меткой компонента ПГ. Мы описываем покадровой эксперимент наблюдать G3BP1 содержащих ГХ в мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Этот метод также может быть использован для изучения G3BP содержащих ГХ в живых нейронов, что имеет решающее значение, как недавно было показано, что эти SGs формируются в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Этот подход может быть адаптирован к любым другим компонентом клеточного тела и гранулы белка, и выполняетсяс трансгенными животными, позволяя живой исследование динамики гранул, например, в отсутствие конкретного фактора этих гранул.

Введение

Стресс гранулы (SGS) не являются мембранные цитоплазматический очаги образуются в клеточном защитной реакции на воздействия окружающей среды, например, повышенной температуре, окислительный стресс, гипоксия, осмотического шока, УФ-облучения, лишение глюкозы или вирусной инфекции ^1. Они могут быть индуцирован химически путем обработки соединений, таких как арсенита натрия, который вызывает окислительный стресс. SGs накапливаются тупик перевода арестован посыльного рибонуклеопротеин (mRNPs) комплексы ^2, наложение ареста мРНК от трансляционного аппарата, и их сборка может быть вызвано фосфорилирования eIF2α (коэффициент эукариотической инициации 2 α). SGs динамические структуры, которые обмениваются компоненты с полисом и других гранул, как Р-органов. Они представляют собой «сортировки центр", где мРНК сортируются и обрабатываются либо перевода, реинициацию, деградации или упаковки в стабильных, не полисомной mRNPs ^3. Сборка ПГ быстро бут это постепенный процесс с начальными многочисленных мелких агрегатов, которые сливаются в более крупные гранулы. Использование химических ингибиторов, которые нарушают или стабилизации микротрубочек показывает, что микротрубочки сети требуется для динамики SG включая монтаж, слияний и разборки процессов.

Динамическая сборка ПГ способствует также агрегации конкретных РНК-связывающих белков (РНК-ВР), как TIA-1 (Т-клеток внутреннего антиген-1) и TIAR (TIA-1, связанных белка), которые способны димеризуются и способствовать полисом разборку и маршрутизацию мРНК в ИК ^4. G3BP (RasGAP SH3 домен связывающий белок) такова, РНК-ВР, что локализуется в ИК когда клетки подчеркнуть, с арсенитом или при высокой температуре, и избыточная экспрессия дефосфорилированного G3BP может индуцировать SGS узел ^5.

G3BP является эволюционно консервативными РНК-ВР, который был первоначально характеризуется через его взаимодействия с белка, активирующего Рас-GTPase (RasGAP р120 ^6); но это взаимодействие было недавно повторно ^7. Семья G3BP входят два члена у млекопитающих, G3BP1 (именуемые G3BP) и G3BP2 ^8. Оба белка локализуются в ИК, когда клетки подвергаются стрессу ^9. G3BPs включают N-концевой домен NTF2 предложил оказывать влияние на их локализацию и олигомеризации, а затем пролина (PxxP) мотивы, то С-концевые мотивы, связанные с связывания РНК: каноническое РНК-Recognition Motif (RRM) с консервативных RNP1 и RNP2 мотивов , с последующим богатой (РГГ) окне аргинин-глицин. Интересно, что анализ различных частях белка путем построения разные домены, слитые с EGFP показали, что NTF2-подобного домена и РНК-связывающий домен были наиболее эффективно нанят для ПГ, предполагая важность свойств димеризации и связывания РНК в сборка ПГ. Разнообразные модели выявили различные функции G3BP белков в пробирке ^10-13.Срыв G3BP в мышах показали важность этого белка в росте развития и выживания ^14, а также важную роль для G3BP в центральной нервной системы (ЦНС), характеризуется атаксией и дефектов в пространственной рабочей памяти ^15. Дефицит G3BP приводит к измененной нейронов пластичности и кальция гомеостаза, устанавливая прямую связь между формированием SG и нейродегенеративных заболеваний ^15. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность изучить динамику ПГ в первичных клеток, как нейроны.

Этот протокол обеспечивает простой способ наблюдать сборку G3BP1 содержащих ИК в первичных клеток на лечении арсенит. Он может быть использован для изучения SGS сборки при различных условиях, например, различные виды нагрузок. Он также может быть приспособлен к другим гранул или других компонентов ПГ. В самом деле, этот протокол фокусируется на G3BP1, но есть и другие гранулы стресс маркеры, как TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (ломкой Х Умственная отсталость Синдром белок) ^16, TDP-43 (ответ транзактивной ДНК-связывающего белка 43) ¹⁷ или Staufen ^18. В частности, белки, такие как TIA-1 / R, подобно G3BP, зародышеобразования РНК связывающих белков, которые могут вызвать SGS сборку при избыточной экспрессии, даже если различные образованные SGs может отличаться в зависимости, регулирования и связанных с ними транскриптов. Трансфекция флуорофора с метками версии любой из этих ключевых компонентов или нуклеаторов из ИК могут быть выполнены, чтобы изображения конкретной сборки и динамики SGS.

протокол

Все животные процедуры в настоящем Протоколе в строгом соответствии с руководящими принципами Директивы Европейского сообщества Совета от 24 ноября 1986 (86-609/EEC). Дом мышей в группе, что позволяет пищу и воду без ограничений. Поддерживать их в контролируемой среде (22 ± 1 ° С, 55 ± 5% влажности) с 12 часов: 12 часов света: темно-цикла (свет на в 7:00).

1 Культура мышиный первичных элементов:. Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)

1. Автоклав тонкие щипцы, а также изогнутые щипцы и рассекает ножницы. Хранить в стерильный контейнер. С помощью стерильного D-PBS (Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором). Подготовить всю MEFs среда: модифицированный Дульбекко среде Игла (DMEM) / F12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот и 0,5 мМ 2-меркаптоэтанола и теплый при 37 ° С
2. Усыпить беременную мышь (на 13,5 дней после коитуса (DPC)) Путем смещени шейных позвонков. Удалите рога матки от мыши продезинфицировать с 90% этанола. Под стерильной и чистой капотом, разместить рога с эмбрионов в 37 ° С, предварительно нагретую D-PBS. Откройте рога, место эмбрионы в 100 мм стерильный пластиковый чашку Петри, очистить их от пупочной материала мозга и мыть их теплой D-PBS для удаления избытка крови. Под бинокль, удалить конечности эмбриона, внутренние органы и верхняя часть головы, содержащей мозг.
3. В новом чашку Петри, пропустить через мясорубку эмбрионов в очень мелкие кусочки хирургический стерильный лезвие или ножницы (по крайней мере в течение 1 мин). В случае эмбрионов разных генотипов, будьте осторожны, чтобы поставить каждого эмбриона в отдельных чашках Петри и держать хвост или верхнюю головку для генотипирования.
4. Крышка эмбрион с 1x трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина, 1 мМ ЭДТА). Выдержите в течение 30 мин до 1 часа в 37 ° C инкубаторе. Добавьте 10 мл в комплектеMEFs среднего остановить реакцию трипсина. Внесите вверх и вниз, чтобы удалить все агрегаты. Пусть сидят клеточной суспензии в 50 мл пробирку (наполненной полной среде) в течение 10 мин, и супернатант центрифугируют в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок в полной среде (6 мл на 1 эмбриона). Жизнеспособные ядерных клеток можно пересчитать с помощью Трипановый синий (Около 5 х 10 ⁶ клеток можно ожидать от одного эмбриона). Пластинчатые 3 мл на 60 мм чашки Петри.
5. Измените среду на следующий день и позволяют клеткам расти пока блюда не сливающийся. Многие типы клеток можно видеть, но только фибробласты выживет субкультуру.
6. Сплит клетки и позволить им не расти в 35 мм чашки с стеклянным дном (важно для эксперимента длительной записи), пока 50-70% слияния для трансфекции. Тест на микоплазмы и патогенов мыши.

2. Культураdaptations в случае нейронов

1. За день до культуры, слой 35 мм со стеклянным дном чашки Петри с поли-L-лизина (200 мкл 0,1 мг / мл) в стерильном и чистый капот, и оставьте на ночь.
2. На следующее утро, промыть стерильной чистой воды, дважды в течение 5 мин и один раз в течение 45 мин до 1 часа. Заменить с 2 мл DMEM плюс 10% FBS среды и держать в инкубаторе 37 ° C.
3. Проанализируйте эмбрионов на 18,5 DPC. Под стерильной и чистой капотом, разместить рога с эмбрионов в холодной стерильной HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) в 100 мм чашки Петри. Новорожденных щенков также может быть использован вместо эмбрионов в целях сохранения жизни плотины и дать ему возможность производить больше потомства, особенно в случае трансгенных животных, которые могут быть трудно получить. В отдельных чашках Петри, принимать каждый эмбрион или новорожденного и отрезать голову ножницами. Держите голову, вставив изогнутых щипцов в глаза, порезать кожу и осторожно откройте мягкую череп со спиныголовы до глаз, на каждой стороне головки. Разрежьте зрительные нервы и ствол головного мозга, удалить мозг, и положил его в новом чашку Петри, содержащую HBSS. Под стереоскоп, удалить все мозговые оболочки, используя две тонкие щипцы. Отделите гиппокампа, коры или любой другой части мозга в зависимости от структуры, чтобы учиться.
4. Погрузите расчлененный структуру мозга в 4,5 мл холодного HBSS подготовлен ранее в 15 мл пробирки и держать на льду до расщеплением трипсином. Добавляют 0,5 мл 2,5% трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин до 20 мин. Промойте трипсина 3 раза с HBSS, будучи чрезвычайно осторожны, чтобы не отказаться от переваренных части мозга.
5. Ресуспендируют в 500 мкл (гиппокамп) в 1 мл (кора) DMEM плюс 10% FBS и пипетки вверх и вниз несколько раз с 1 мл микропипетки, снабженной наконечником 1 мл, а затем оснащен 1 мл плюс 200 кончиков мкл, пока не будет нет видимая совокупность.
6. Распределить 100-200 мкл клеточной суспензии в каждую 35 мм стекла Bottoм Петри, содержащие DMEM плюс 10% FBS, и пусть нейроны придерживаться при 37 ° С в течение по крайней мере 3 часов. Заменить на предварительно нагретые нейронов полной среде (Neurobasal среде, дополненной 250 мкМ L-глутамина и NS21, полученного, как описано в Chen и соавт. ¹⁹⁾ и оставить на 37 ° С, чтобы позволить роста нейронов. Трансфекции нейронов от 5 до 14 дней в пробирке (дел) (эффективность трансфекции выше через пару див, но синаптических связей лучше создана с 7-10 дел).

3. Трансфекцию EGFP-G3BP1 Construct

Трансфекции клеток вектором, содержащим кДНК вашего интерес белка (любой компонент ПГБ), слитого с флуоресцентным маркером (GFP, YFP и т.д.), с использованием 3 мкг очищенной плазмиды в 35 мм чашку.

1. Трансфекции MEFs используя коммерческий метод, следуя протоколу производителя (см. таблицу материалов / Реагенты).
2. Трансфекции нейронов с кальциемфосфат метод адаптирован из Ся и др. ²⁰ кратко.:
   1. Подготовка решения: DMEM-стирка: DMEM, содержащей 25 мМ KCl; трансфекции решение: DMEM-краска, которая содержит 1x DMKY (HEPES 5 мМ, MgCl _2, 10 мМ, фенол красный); и шок решение: HeBS 1x, 1x DMKY и ДМСО 2% (объем / объем); и держать их при 37 ° С
   2. Извлеките носитель из нейронов, фильтрата, и держать его при 37 ° С Промыть DMEM стирки затем заменить трансфекции среды и держать при температуре 37 ° С в течение подготовки фосфата кальция-плазмиды осадков ДНК.
   3. В 1,5 мл трубки микроцентрифужных, добавить (в этом порядке) Braun воды (конечный объем 50 мкл), 5 мкл CaCl ₂ 2,5 м, и 3 мкг ДНК плазмиды. Оставьте эту смесь на 50 мкл HeBS 2x уже введенных в круглом снизу полипропиленовую трубку. Смешайте трубки при вращении вместе с опусканием. Пусть форму осадка при комнатной температуре в течение 30 мин.
   4. Добавьте precipitatе капл м на нейронах и оставить при 37 ° С в течение от 30 до 50 мин.
   5. Замените ударной раствор в течение 1 мин, затем смыть DMEM стирки и, наконец, вновь ввести выдержано среду. Держите клетки при 37 ° С.

4. Визуализация G3BP Содержит SGS Ассамблею и динамика

1. Заменить среда клеток, который содержит фенол красный по фенолового красного среде.
2. Используйте конфокальной микроскопии, оснащенный флуоресценции для приобретений. Включите систем микроскопа: ртутная лампа, компьютер и лазеры. Разминка в камеру до 37 ° С не менее 20 мин до начала приобретений.
3. Над выражением G3BP индуцирует спонтанное формирование типа ПГ. Эти клетки могут таким образом быть соблюдены для сборки SGs 24 часами сразу после трансфекции без индукции стресса. Кроме того, стресс может быть вызван в дальнейшем вызвать сборку ПГ. Добавить 0,5 мм арсенит натрия и звездут о приобретении сразу после добавления соединения (гранулы будут хорошо сформированной в течение 1 часа).
4. Добавить масло в иммерсионного объектива (использовать 40x или 63x целей) и установить чашку Петри над целью в адаптированном 35 мм держатель микроскопа, стабилизировалась на держателе стадии. Убедитесь, что блюдо плоским иначе приобретения будут изменены. Включите света флуоресценции в соответствии с соответствующим флуорофора и визуализировать трансфицированных клеток. Выключите флуоресценции раз клетка представляет интерес в области, чтобы минимизировать отбеливание и цитотоксичность.
5. В "приобрести вкладке" выберите лазеров в зависимости от длины волны возбуждения флуорофора тега (488 нм в нашем протоколе, который использует EGFP-тегами G3BP) и выберите адаптированный длину выбросов для ФЭУ (ФЭУ). Регулировка мощности лазера (обычно не более чем 10%), чтобы минимизировать шум и перенасыщение, а также токсичности, и установки усиления и смещения для изменения отношения сигнал-шум.Сканирование быстро (1000 Гц), с тем чтобы свести к минимуму продолжительность лазерного экспозиции (строка средний 2, рама средний 1). При желании, установить параметры для Z стека, чтобы иметь возможность восстановить изображение в 3D (Z шаг 1 мкм, как правило, хорошо с клетками). Определить интервал времени между каждым приобретения: меньшие интервалы позволяют получить более согласованной фильм, но это может вызвать фотообесцвечивания и токсичность (интервал 20 сек была использована в описанных опытах). Продолжительность полного приобретения может варьироваться в зависимости от типа стресса. Многие G3BP содержащих SGs формируются очень быстро проходит лечение арсенит и хорошо видны через 1 час лечения: в этом случае, выберите быстро клетки, чтобы фильм и начать приобретений сразу после стресса, с общей продолжительностью приобретения 15 - 20 мин в основном достаточно заметить, сборку нескольких ПГ.
6. Сохранить фотографии и реконструировать стеки и кино, используя ImageJ программного обеспечения.

Результаты

Формирование Стресс гранула имеет важное значение в реакции клеток на стресс, позволяя сотовый адаптации с заблокированным перевода, пока стресс не освободится, связанные с предотвращением апоптоза. Разрешения на этом анализе для изучения ГХ в первичных клеток, следуя локализации кл?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги в протоколе озабоченностью трансфекции и более конкретно приобретений промежуток времени, которые должны быть тщательно проверены, чтобы снизить вниз цитотоксичность.

Культура первичных элементов не является трудной частью, пока стерильные усло?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5