JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Администрация двух аналогов тимидина, EDU и BrdU, у беременных мышей позволяет проводить анализ клеточного цикла в нервной и клеток-предшественников в эмбриональном мозге мыши. Этот метод полезен для определения последствий генотоксического стресса, в том числе ионизирующего излучения, во время развития мозга.

Аннотация

Нейроны коры головного мозга генерируются во время развития мозга от различных видов нервных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), которые образуют псевдомногослойный эпителий накладки боковых желудочков эмбрионального мозга. Генотоксические стрессы, такие как ионизирующего излучения, имеют весьма негативное влияние на развивающийся мозг, связанной с высокой чувствительностью NSPC. Выяснение клеточных и молекулярных механизмов, вовлеченных зависит от характеристик ответа на повреждения ДНК этих конкретных типов клеток, что требует точный метод для определения прогрессирования NSPC через клеточного цикла в поврежденной ткани. Здесь показан способ, основанный на последовательных внутрибрюшинных инъекций ОБР и BrdU у беременных мышей и дальнейшего обнаружения этих двух тимидина аналогов в корональных секций эмбрионального мозга. EDU и BrdU оба включены в ДНК реплицирующихся клеток во время S фазы и обнаруживаются двух различных методов (азидных илиспецифическое антитело, соответственно), которые облегчают их одновременное обнаружение. EDU и окрашивание BrdU затем определяются для каждого ядра NSPC в зависимости от удаленности от желудочка перевесом в стандартной области спинной мозге. Таким образом эта двойная техника маркировки позволяет выделить клетки, которые в ходе освоения клеточного цикла от тех, которые активировали контрольную точку клеточного цикла, ведущих к остановке клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК.

Пример эксперимента представлена, в котором EDU вводили до облучения и BrdU сразу после и проведение анализа в 4 ч после облучения. Этот протокол обеспечивает точный анализ повреждений ДНК ответ острой из NSPC в зависимости от фазы клеточного цикла, на котором они были облучены. Этот метод легко транспозонов и во многих других системах, чтобы определить воздействие конкретного лечения на прогрессирование клеточного цикла в живых тканях.

Введение

Во время эмбрионального развития головного мозга, проекционные нейроны коры головного мозга генерируются в вентрикулярной зоне, псевдомногослойный эпителий состоит из различных типов нейронных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), что линии боковые желудочки. Среди NSPC, радиальные глиальные клетки (RGC), которые служат нервных стволовых клеток, претерпевают интеркинетической ядерного миграции (INM): они выполняют митоз на поверхности желудочка и S-фазе при базальном предела вентрикулярной зоне (ВЗ) 1, 2,3. Они могут разделить либо симметрично, чтобы генерировать два RGC или асимметрично, чтобы генерировать один RGC и один нейрон или промежуточной клеток-предшественников (IPC) 4, 5. МПК мигрировать в слое покрывающей пролиферирующих называемой субвентрикулярной зоне (SVZ), где после одного последнего симметричного деления они создают два незрелых проекционные нейроны 6-8. Вопреки РГК, МПК не подвергаются INM (обзор в 9). Вновь созданный нейроны Migrели радиально вдоль радиальных волокон через промежуточную зону (ИЗ), чтобы достичь конечного пункта назначения в кортикальной пластинки (СР) 10, 8. Идеальное время всех этих событий имеет важное значение для правильного развития коры. Например переход от распространения в дифференциации нервных населения предшественников контролируется продолжительности G1 фазы 11, 12. Таким образом, удлинение фазе G1 коррелирует с клеточной дифференцировки.

Генотоксический стресс, такие как ионизирующего излучения, строго отрицательно воздействовать на развитие головного мозга (обзор 13). Мы и другие показали, что NSPC весьма склонны к радиационно-индуцированного апоптоза 14 15,16. Ионизирующих излучений вызывать ДНК двойные разрывы цепи, которые являются наиболее серьезный ущерб пролиферирующих клеток. Один из важнейших компонентов повреждения ДНК реагирования (РДР) в велосипедных клеток является активация контрольно-пропускных пунктах клеточного цикла в / M переходов G1 / S или G2 или во время Sфаза (внутри-S контрольно-пропускной пункт) 17-21. Они блокируют прогрессирование клеточного цикла, чтобы предоставить время для ремонта повреждений ДНК или ликвидации слишком поврежденных клеток. Следовательно, гибель клеток, а также ход клеточного цикла задерживается может изменить развитие мозга в ответ на ионизирующего излучения экспозиции 22-24. Таким образом, было интересно разработать метод оценки активацию клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов в NSPC в облученной мышиных эмбриональных мозга.

Прогрессирование клеточного цикла следует регулярно использующих включение тимидина аналоговых, 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU). BrdU вводят во время S-фазе клеточного цикла, когда ДНК репликацию. Использование антитела против BrdU позволяет впоследствии обнаружение клеток, которые были в S фазе в течение импульса BrdU.

Новый аналог тимидина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина (ОБР) детектируется посредством флуоресцентного азида. Различные способы обнаружения EDU и В РДУ не перекрестно реагируют 25, что позволяет одновременное обнаружение обоих аналогов тимидина, что полезно для изучения клеточного цикла. Обычно клетки сначала импульсно Edu, а затем импульсно BrdU, где время между обеими инкорпорации длится пару часов 25, 26. Добавление BrdU в культуральной среде, содержащей ОБР приводит к включению предпочтительно BrdU в ДНК с вытеснением ОБР, в то время как одновременное добавление ОБР 25 с эквимол рным или половина эквимол рном BrdU к результатам медиа только в BrdU включения 27. Это упрощает двойной протокол маркировки, устраняя шаги мыть, которые обычно требуют, чтобы удалить первую метку из культуральной среды перед добавлением второй этикетке. Это также относится к особый интерес для в естественных условиях исследования, где шаги стиральные невозможно, чтобы определить точные сроки ввода S фазы или выходе из клеточной популяции.

т "> Недавно был предложен способ маркировки двойного импульса в эмбрионального мозга мыши с использованием ОБР и BrdU 23, 24,22 была разработана для анализа прогрессии клеточного цикла и INM из NSPC после облучения в матке. Более того было показано, что в ходе S фазы, клетки мыши повторить вначале Эухроматин регионы и затем перицентрического гетерохроматина 28,29,30. Интересно, перицентрический гетерохроматина разных хромосом сосредоточены в интерфазовыми ядер с образованием гетерохроматиновых очаги также известный как хромоцентров и легко обнаруживаемый окрашиванием DAPI как яркий очагов. Таким образом, дифференциальные EDU и BrdU окрашивание из эухроматина и хромоцентров помогли нам проанализировать точнее S фазы прогрессирования NSPC.

Этот метод позволил демонстрацию очевидного отсутствия G1 / S контрольно-пропускном пункте в НМТП 22-24, что вполне удивительно, так как это контрольно-пропускной пункт, как предполагается, является критическим для стабильности генома. Несколько ехрerimental проекты, основанные на различных комбинациях EDU и BrdU импульсов были использованы для анализа прогрессию клеточного цикла в брюшной и спинной мозге. Здесь мы приведем пример протоколов, позволяющих изучение острого повреждения ДНК NSPC в течение первых 4 часов следующего внутриутробное облучения эмбрионов E14.5 мыши.

протокол

1. Процедуры животных

Этот протокол был разработан в соответствии с Директивой Европейского Совета Сообщества от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) и была одобрена нашей институциональной комитета по защите животных (CETEA-ЦЭА DSV IDF).

  1. Инъекции с EDU / BrdU и облучения E14.5 беременных мышей (рис. 2а).
    1. Готовят раствор ОБР при концентрации 1 мг / мл и BrdU в 5 мг / мл в PBS. Выполните внутрибрюшинную инъекции (IP) 100 мкл раствора EDU с помощью иглы 25 G в беременных мышей. 1,5 ч. Через облучать мышей (общее облучение тела) при 0 Гр или 2 Гр (0,6 Гр / мин). Сразу же после инъекции (IP) 200 мкл раствора BrdU с помощью 25 G иглу в беременных мышей.
  2. Подготовка корональных ломтиками эмбриональных мозгов.
    1. В 1 час или 4 часа после облучения, усыпить беременных мышей углекислым газом.
    2. Откройте в животе Кавити в течение трех сантиметров, используя ножницы. Отделите две рога матки от остальной части матки секционирования обе конечности рога. Перенесите рога матки в чашку Петри, содержащую PBS 0,6% глюкозы. Откройте рога матки с пинцетом, чтобы изолировать эмбрионов. Удалить амниотической полости каждого эмбриона с помощью щипцов.
    3. Проанализируйте эмбриональных головы щипцами и исправить их путем погружения в 4% параформальдегида (PFA, рН = 7,4) O / N при 4 ° С.
    4. Промыть эмбриональных головы в PBS в течение по крайней мере одной ночи при 4 ° С. Головки могут быть сохранены в PBS в течение нескольких дней.
    5. Код для вставки головки в парафин с использованием процессора вакуумной пропитки, как указано в таблице 1. Главы вложения также может быть выполнена в соответствии с химической капот для этанола и Ксилен ванны, а затем в печь 65 ° С в течение парафиновые аппликации.
    6. Подготовка толстые корональные разделы 5-мкм с микротоме.
    7. Установите на полилизиновых покрытием микроскопа.
    8. Слайды можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение нескольких месяцев.

2. EDU / BrdU окрашивание

  1. Депарафинирование и антиген разоблачение
    1. Deparaffinize разделы мозга в парафин погружением слайдов в 3 ванны толуола в течение 5 мин.
    2. Увлажняет в течение 3 мин в 2 ваннами каждого решений уменьшением концентрации этанола следующим образом: этанол 100%, этанол 95%, этанол 70%, а 5 мин в H 2 O. Слайды можно хранить в деионизированной воде в течение нескольких часов.
    3. Варить ломтики в течение 10 мин в растворе цитрата (10 мМ, рН 6), а затем инкубируют в деионизированной воде в течение 5 мин.
  2. Окрашивание EDU
    1. Выполните обнаружение EDU соответствии с протоколом производителя. Проницаемыми клетки с 0,5% тритона Х-100 в ЗФР ​​в течение 10 минут.
    2. Подготовка 1X буферного ОБР добавку путем разбавления раствора 10X в деионизированной воде. Это решение должно быть недавно сделанный и использовать на одном дау.
    3. Подготовка EDU реакции коктейль, в том числе EDU Alexa Fluor 488 азида. Важно, чтобы добавить следующие ингредиенты порядке, указанном в таблице 2, в противном случае, реакци не будет действовать в оптимальном режиме. Используйте реакции коктейль Edu течение 15 мин подготовки.
    4. Снимите буфер пермеабилизации (шаг 2.1.1), затем промыть дважды PBS.
    5. Добавить 150 мкл EDU реакции коктейля, положить покровное и инкубировать в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.
    6. Извлечь тестовую коктейль EDU, то мыть один раз с PBS.
  3. Окрашивание BrdU
    1. Получают буфер насыщения с 7,5% козьей сывороткой и 7,5% фетальной бычьей сыворотки в PBS. Добавить 150 мкл буфера насыщения на срезах мозга, положить покровное и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифическую связывания антитела.
    2. Удалить покровное. Добавить 150 мкл мышиного антитела против BrdU первичного антитела, разведенного в 1/300 в буфере насыщения, положить покровное и инкубировать O /N при 4 ° С.
    3. Удалить покровное, затем промыть 3 раза в PBS.
    4. Добавить 150 мкл козьего антитела против мышиного-Alexa594 вторичного антитела, разбавленного в 1/400 в буфере насыщения, положить покровное и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
    5. Удалить покровное, то мыть один раз в PBS.
    6. Ядерное окрашивание: добавить 150 мкл 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на 1 мкг / мл в PBS, положить покровное и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
    7. Установите слайды по монтажу среду.

3. Анализ

  1. Изучить срезы головного мозга под флуоресцентным микроскопом с целью 20X или конфокальной микроскопии и получать изображения в трех каналах (488 нм, 594 нм и UV) в качестве отделяет файлов.
  2. Стек изображения с программным обеспечением Photoshop.
  3. Анализ срезы головного мозга в стандартном секторе дорсомедиальной головного стене. Этот сектор составляет 100 мкм в медиальной-поперечный размер и делится на 18 бункеров (или более) из 10 μВысота м в его радиального размера с использованием сетки, наложенной картинки (рис. 1), как описано выше 31.
    1. Выравнивание сетки, такие как первый бункер находится на поверхности желудочков, с его длинной оси, параллельной желудочка границы. Тогда номер меченого EDU, BrdU и / или пикнотические ядра (соответствующий апоптоза ядер) в каждом мусорном ведре. Число а ядро, расположенный на границе двух бункеров в мусорное ведро, которое содержит его большую часть, или в нижнем бункере, когда ядро ​​занимает равные площади в течение двух бункеров.
  4. Статистический анализ.

Анализ по меньшей мере два кортикальных срезов за эмбриона. Повторите эксперименты по крайней мере 3 эмбрионов из разных пометов. Результаты должны быть заданы как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ проводятся с GraphPad Prism с помощью двусторонней ANOVA и Бонферрони несколько тестов сравнения posthoc.

Результаты

В эксперименте, описанном на фиг.2, ОБР вводили 1,5 ч перед облучением и BrdU только после облучения. Четыре типа Затем клетки отличаются в корковых срезов, полученных на 1 или 4 ч после облучения, в соответствии с введением либо ОБР или BrdU, оба или ни (фигуры 2A и 2B). В?...

Обсуждение

Схема эксперимента описана здесь на основе включения ОБР 1,5 ч перед облучением и включение BrdU сразу после облучения позволило демонстрацией того, что NSPCs способны активировать S и G2 / M контрольные точки, но не контрольных точек G1 / S в течение 1-го часа после генотоксичным напряжение...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов.

Благодарности

Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программе Европейского союза (FP7/2007-2013) под грантового соглашения N ° 323267 от Электрисите де Франс (EDF) и от Национальное агентство De La Recherche - Sante-ENVIRONNEMENT др. Здоровье-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
MicrotomeLeicaRM 2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kitLife TechnologiesC10083
Anti-BrdUGE HealthcareRPN2021/300
Goat anti mouse-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
Polysine slideThermo scientificJ2800AMNZ
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
Microscope BX51Olympus
Confocal microscope SPELeica
Prism softwareGraphpadVersion 5.0c
Photoshop softwareAdobe

Ссылки

  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
  4. Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
  5. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
  6. Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
  7. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
  8. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
  9. Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
  10. Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
  11. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
  12. Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
  13. Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
  14. Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
  15. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
  16. Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
  17. Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
  18. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
  19. Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
  20. Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
  21. Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
  22. Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
  23. Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
  24. Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
  25. Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
  26. Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
  27. Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
  28. Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
  29. Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
  30. Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
  31. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  32. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

87BrdUembronic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены