Маточно-трубное Эмбрион Трансфер и Вазектомия в мышиной модели

Резюме

Маточно-трубное перенос эмбрионов использует маточно-трубное соединение в качестве барьера, чтобы предотвратить отток эмбриона, которые могут возникнуть при выполнении передачи матки. Вазэктомии мужчины обязаны получить псевдобеременных получателей переноса эмбрионов. Обсуждаются Оба метода.

Аннотация

Перенос эмбрионов предимплантационной суррогатной женщина является необходимым шагом для производства генетически модифицированных мышей или изучать эффекты эпигенетических изменений возникла в процессе развития предимплантационной на последующее развитие плода и здоровье взрослых. Использование эффективной и последовательной методики переноса эмбриона имеет решающее значение для повышения поколение генетически модифицированных животных и определить влияние различных методов лечения на имплантации ставок и выживания к перспективе. Эмбрионы на стадии бластоцисты, как правило, передается переводом матки, выполняя прокол в стенке матки ввести манипуляции эмбрион пипетки. Отверстие выполняется в матке не закрывается после пипетка была снята, и эмбрионы могут отток в брюшную полость в связи с положительным давлением матки. Прокол может также произвести кровоизлияние, что ухудшает имплантацию, блокирует перенос пипетки и может повлиять эмбриона дАЗВИТИЕ, особенно когда эмбрионы без Zona передаются. Следовательно, этот метод часто приводит к очень переменными и общей выживаемости низким эмбриона. Как избежать этих негативных последствий, маточно-трубное перенос эмбрионов воспользоваться маточно-трубное стыке как естественный барьер, который препятствует оттоку эмбриона и избежать прокола стенки матки. Вазэктомии мужчин необходимы для получения псевдобеременных получателей. Техника для выполнения вазэктомии описывается как дополнение к маточно-трубное переноса эмбрионов.

Введение

Перенос эмбрионов, вероятно, наиболее часто хирургическая процедура, проводимая в модели мыши. Эта техника имеет важное значение для получения потомства от эмбрионов, подвергнутых в пробирке методов манипуляции и, следовательно, является необходимым шагом для развития генетически модифицированных моделей по пронуклеусов инъекции, лентивирусным трансдукции, или образования химер. Кроме того, методика позволяет изучение развития последствий различных оскорблений, происходящих в процессе разработки предимплантационной. Использование искусственных репродуктивных технологий ¹ или воздействия аномальных концентраций различных веществ или метаболитов ^{2 мая} влияют на развитие эмбриона в результате имплантации или плаценты неудач и долгосрочных эффектов у потомства. Надежные и воспроизводимые техника перенос эмбрионов имеет решающее значение для проверки возможных негативных последствий экспериментального лечения по имплантации и развития плода в согласованном человеканер.

Мышиные эмбрионы предимплантационная могут быть переданы женщина получателя либо в яйцевод через ампул 0,5 дней после коитуса (ЦОД) псевдобеременных получателей (передача яйцевод) ^3,4 или в матку 2,5 получателя псевдобеременных DPC (передача матки) ^5,6 в зависимости от их стадии развития. Эмбрионов на стадии бластоцисты, такие как те, которые используются для генерирования химерных мышей путем инъекции эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые обычно передаются путем перевода матки. Бластоцисты также могут быть переданы в яйцевод реципиента 0,5 DPC, но она представляет собой менее физиологическое испытание для разрушителей развития, потому что эмбрион претерпевает диапаузы и имеет 2 дня, чтобы оправиться от инсульта до имплантации происходит. Передача матки включает в себя прокалывание стенки матки с узкой иглы, чтобы генерировать отверстие, что позволяет доступ эмбриона манипуляции пипетки в просвет матки.отя эта техника может дать хорошие результаты, выживание в перспективе (то есть процент эмбрионов, которые развиваются на щенка) часто низкая и непредсказуемым ^7,8.

Прокол стенки матки влечет за собой некоторые негативные побочные эффекты. Во-первых, миометрий является высоко развитую сосудистую ткань, и его прокол часто приводит к небольшим кровотечением. Кровь может блокировать перенос эмбрионов пипетки или вторгаться матки просвет вызывая эмбриональную смерть и / или неудачи имплантации. Это особенно актуально, когда эмбрионы без Zona передаются, так как кровяные клетки и мусор можно прикрепить к бластомеров. Во-вторых, открытие выполнены не запечатывает после эмбрионы были переданы, так что они могут течь обратно через отверстие и быть исключен в брюшной полости при слишком большой объем был ввести в матку. Маточно-трубное перенос эмбрионов описано здесь воспользоваться маточно-трубное стыке доставить EMBRйо в матку без необходимости прокалывания стенки матки и таким образом избегая его негативных последствий ^9.

Самки получателей псевдобеременных, используемые для переноса эмбрионов получены путем естественного спаривания с вазэктомии мужчин ^8. В семенных выделений, полученные с помощью стерильных самцов необходимы для матки, чтобы стать восприимчивыми к переданных эмбрионов. Для получения адресата, максимум 2 самок 8 недель до 6-месячного возраста размещаются с вазэктомии мужчина днем. На следующее утро, женщины проверяются на наличие вагинального совокупления вилкой, скопления коагулированных белков из мужской семенной жидкости. Как спаривания обычно происходит во время полуночи, в день влагалища обнаружения плагина считается 0,5 сантиметр. Хотя вазэктомии самцы могут быть приобретены у некоторых производителей, хирургической процедуры описанные здесь относительно легко и не требует никаких дополнительных инструментов, чем требуется для переноса эмбриона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В соответствии с USDA уходу и использованию животных Руководства Все эксперименты на животных были утверждены Белтсвилль Площадь уходу и использованию животных Комитеты (BAACUC 11-015).

1. Анестезия и обезболивание (общий для обоих хирургических процедур)

1. Взвесьте мыши и загружать следующие анестетики и анальгезирующее в двух 1 мл шприцев с 27 г хвои:
   1. Кетамин (0,1 мг / г: 0,01 мл / г раствора 10 мг / мл) и ксилазина (0,01 мг / г: 0,005 мл / г раствора 2 мг / мл).
   2. Бупренорфин (0,1 мкг / г: 0,01 мл раствора 0,01 мг / мл).
2. Остановите мышь, поднимая загривок шеи как можно ближе к челюстям, насколько это возможно с большим и указательным пальцами и держа хвост между маленькими и безымянным пальцами.
3. Введите Кетамин-Ксилазин смесь внутрибрюшинно. Для того чтобы избежать прокалывания внутренние органы, держать мышь сего голова слегка ниже уровня своих бедер (рис. 1А)
4. Введите Бупренорфин подкожно в загривок шеи удержание между большим и указательным пальцами (рис. 1В).
5. Оставьте мышь в клетке (чистой и без любого другого животного) в теплый этапе.
6. После того, как в бессознательном состоянии, проверьте отсутствие задней ноги рефлекса (проверяется ног крайнем случае). Применить глазную мазь, чтобы избежать сухости глаза и, чтобы проверить на отсутствие глазной рефлекс (рис. 1в).
7. Этот протокол обеспечивает хирургическую анестезию самолет в течение как минимум 30 мин, что достаточно для выполнения процедур, описанных ниже (протоколов 2 и 3). Если более длительное время требуется, дополнительные инъекции кетамина + ксилазина с половины дозы, описанной в 1.1.1 может быть применен после 30 мин. Изменение в структуре дыхания к более быстрому и нерегулярной одной указывает лосс надлежащего анестезии плоскости.

2. Вазэктомия

1. Используйте мужчина с проверенной производительности спаривания.
2. Стерилизовать хирургических инструментов, очистки поверхностей, где будут выполняться операции и уничтожить их с 70% этанола.
3. Выполните анестезии, как ранее подробно (Протокол 1), проверка на потерю рефлексов.
4. Наведите мышь на теплый этапе удалить мех электрическими ножницами из вентральной области между двумя воображаемыми поперечными линиями размещены 0,5 см и 2,5 см выше пениса (рис. 2а).
5. Sanitize бритая область последовательным вытирая с 10% раствор йода и 70% этанола.
6. Наведите в положении лежа на спине со своим хвостом к хирургу и крышкой с стерильной полотенце с отверстием подвергая бритая области. Освещать хирургическую область.
7. Выполните 10-15 мм продольную incisio кожин в средней линии живота, около 1 см выше полового члена. Держите кожу с соусом зубчатые щипцы, а затем разрезать ножницами (рис. 2А и 2В).
8. Выполните 5-10 мм продольный разрез в белой линии. Держите мышцы с microdissecting зубчатые щипцы и вырезать ножницами (рис. 2в).
9. Захватите яичек жировой блокнот одной стороны с микро рассекает зубчатые щипцы и вытяните ее, чтобы выставить яичка, семявыносящих протоков и придатка яичка. Семявыносящих протоков находится медиальнее яичка и это четко различимая бесплатно трубка (не прикреплен к яичка стене, как придатки) с кровеносный сосуд вдоль одной стороны (рис. 2D).
10. Проведение семявыносящих протоков с микро рассекая на зубчатые щипцы, пламени перевязочных щипцов, пока они не станут красными (рис. 2E ), а затем использовать их, чтобы сократить и прижечь семявыносящих протоков в двух точках одновременно (рис. 2F). Разрез должен удалить часть около 5 мм и оставить два четко разделенных обезболивающий укол концы (рис. 2 г).
11. Перемещение яичка, придатка и семявыносящих протоков обратно в брюшную полость.
12. Продолжать с шага 9 в другой яичка.
13. Шовный мышцы с одним или двумя горизонтальными матрас стежков, сделанных с 5/0 рассасывающиеся нити (рис. 2H).
14. Шовный кожу с одним или двумя раны ножницами (рис. 2I).
15. Определить vasectomised мужчина (сережку, палец татуировки ...), переместите его в клетку помещается в теплый стадии и наблюдать, пока она не оправится от анестезии (сознательного и поддерживать грудины лежачее положение). 0,5-1 мл подкожное введение теплого солевого раствора улучшает повторноновление. Запишите возможные случаи, происходящие во время вазэктомии переводом, добавить антибиотик в питьевую воду.
16. Раны зажимы могут быть удалены через 10 дней после вазэктомии с раной машинки для удаления или пары зубов щипцами. Вазэктомии мужчина будет готов к спариванию 2 недели после операции.
17. Проверьте бесплодия в вазэктомии мужчина в результате скрещивания с плодородными женщин перед использованием его для получения получателей.

3. Маточно-трубное Эмбрионов

1. Мышь морул или бластоцисты могут быть переданы этим методом в псевдобеременных женщины-реципиента на 2,5 DPC.
2. Подготовка эмбрионов манипуляции стеклянную пипетку:
   1. Польский кончики стеклянных капилляров, чтобы избежать повреждения держатель пипетки.
   2. Смягчить среднюю часть стеклянного капилляра при нагревании с тонкой пламени, слегка вращающийсякапиллярная обеими руками синхронно. После того, как раздел капиллярной становится мягкой и податливый (светло-красный цвет), снять ее быстро от пламени и потяните оба конца, чтобы сузить свой ​​внешний диаметр до 130-150 мкм.
   3. Подождите, пока стекло не остынет, и затем разрезать его на слегка забив узкую часть с алмазным точки карандашом, абразивного камня или пилочка для ногтей и потянув с обеих сторон. Перерыв должен быть чистым и перпендикулярно
3. Польский кончик очень быстро пылающий, оставляя 100-130 мкм диафрагмы. Пипетки могут быть сохранены для последующего использования.
4. Теплый манипуляции эмбрион СМИ (CZBH или М2, см. обсуждение).
5. Стерилизовать хирургических инструментов, очистки поверхностей, где будут выполняться операции и уничтожить их с 70% этанола.
6. Выполните анестезии, как ранее подробно (Протокол 1), проверка на потерю рефлексов.
7. Хранение тон мышь на теплый этапе удаления шерсти с электрическими ножницами с дорсальной области между коленей и дистальных ребрами (фиг. 3A и 3B).
8. Sanitize бритая область последовательным вытирая с 10% раствор йода и 70% этанола.
9. Перемещение эмбрионов из инкубатора в предварительно нагретой манипуляции эмбрион массовой информации.
10. Перемещение получателя в теплое сцене под стереомикроскопа и поместить его в положении лежа с боков к хирургу (с его голова смотрит в правую или левую сторону хирурга).
11. Накройте область со стерильным полотенцем с отверстием подвергая бритая область и осветить хирургическую область.
12. Выполните 1 см поперечного (по вертикали) разрез в коже в месте, расположенном на черепной ⅓ линии между последним ребром и бедер и спинной ⅓ линии между задней и живота (3А вй 3B). Держите кожу одеваться зубчатые щипцы и вырезать ножницами (рис. 3C).
13. После того как кожа была сокращена, яичников (красный / оранжевый) или жировой площадку, окружающая яичников (белый) могут быть визуализированы через стенки тела. Выполните 0,3-0,5 см трансверсальную (вертикальный) разрез в стенке тела над яичника или жировой площадку в месте, где разрез не режет любой большой кровеносный сосуд. Держите мышцы с микро рассекая зазубренными пинцетом и вырезать ножницами (рис. 3D).
14. Наведите указатель мыши, чтобы ее голова обращена к хирургу.
15. Загрузите эмбриона манипуляции пипетку (Рисунок 3E):
    1. Разрешить CZBH СМИ не подняться под действием капиллярных сил через узкий части манипулирования пипетки до около 5 мм от широкой части.
    2. Возьмите небольшую пузырь воздуха (0,2-0,5 мм).
    3. Представьте эмбрионов (5-10) вминимальное количество средств массовой информации (2-4 мм).
    4. Возьмем еще один маленький пузырек воздуха (0,2-0,5 мм) и небольшое количество носителей (0,5-1 мм).
    5. Оставьте стеклянную пипетку, прикрепленный к держателю аспиратора рта или к ручным устройством, готовый к шагу 3,17.
16. Возьмите жировой площадку вокруг яичников с микро рассекая зазубренными пинцетом и вытащить его к голове мыши, чтобы разоблачить яичник, яйцевод, и небольшой участок верхней матки из брюшной полости (рис. 3F и 3G).
17. Держа аспиратор рот кусок в рот, готов к использованию, возьмите жировой площадку с микро рассекая зазубренными щипцов для перемещения яйцевод и разоблачить маточно-трубное соединение (т.е. где яйцевод отвечает матку).
18. Ведение маточно-трубное соединение доступно, взять небольшие изогнутые микро рассечение пинцет с левой рукой (если правша) и разместить их чуть нижематочно-трубное перехода захвата яйцевод около 2 мм выше той части.
19. Проведение маточно-трубное соединение с небольшими изогнутыми микро рассечение щипцов, прокол яйцевода раздел близко к пинцетом с 27 G иглы (рис. 3 H).
20. Вставьте эмбриона манипуляции пипетку в отверстие выполняется с иглой и заранее к матке через маточно-трубное стыке (рис. 3I и 3J). После того, как пипетка прошел маточно-трубное соединение (рис. 3K) он скользит легко. Не прогрессировать очень далеко в матку, чтобы предотвратить эндометрия повреждения (не более 3 мм) и блокирование пипетки по обломков.
21. Отпустите эмбрионов в полость матки, осторожно дует (рис. 3 л). Оба пузырьки воздуха должны пройти через матку. Некоторые из СМИ выше первого пузырькатакже могут быть освобождены в матку, но избежать введения больше воздуха, так как это может препятствовать имплантации.
22. Снимите пипетку сразу после эмбрионы были освобождены в матку.
23. Перемещение яйцевод и яичников обратно в брюшную полость, захватывая жировой площадку.
24. Шовный мышцы с горизонтальной матраса стежка с 5/0 рассасывающиеся нити (рис. 3 м).
25. Шовный кожу раны клипера (рис. 3 н).
26. Продолжать с шага 10 на другой стороне, если требуется.
27. Определить получателя (сережку, палец татуировки ...), переместите его в клетку (размещенных в теплый этапе) и наблюдать, пока она не оправится от анестезии (сознательного и поддерживать грудины лежачее положение).
28. Комментировать возможные случаи, возникающие в процессе переноса эмбриона и добавить антибиотик в питьевую воду. 0,5-1 мл подкожное введение теплой SalIпе решение улучшает восстановление.
29. Раны клипы могут быть удалены через 10 дней после переноса эмбрионов с раной клипера удаления или двух пар щипцов (рис. 3 фазы). Получатель может быть взвешены в этот день, чтобы оценить беременности и оценить число щенков. Обеспечить птенец материал получателю через 15 дней после переноса эмбрионов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Маточно-трубное перенос эмбрионов обеспечивает среднее для передачи эмбрионов в матку избегая некоторых осложнений, связанных с матки переноса эмбрионов ^2,9,10. В таблице 1 мы показываем некоторые характерный результат, мы получили передачи CD1 бластоцисты подвергаются ра...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Вазэктомия является относительно прямой хирургическая техника, которая не включает в себя основные трудности. При дезинфекции с повидон-йод и этанола убедитесь, что в прошлом для мытья (этанолом) удаляет повидон йод, так как это может вызвать раздражение брюшины. Доступ к семяпровод?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.