JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Объединив родным и сшивания иммунопреципитацию хроматина с высоким разрешением масс-спектрометрии, ChroP подход позволяет препарировать композитный протеомный архитектуру модификаций гистонов, вариантов и не-histonic белков синергизма в функционально различных доменов хроматина.

Аннотация

Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов сделаны из ДНК и белков, который управляет различными процессами ДНК-зависимой. Структура хроматина и функции в конкретных регионах регулируется местного обогащения гистонов пост-трансляционных модификаций (hPTMs) и вариантов, хроматин-связывающих белков, в том числе факторов транскрипции, и метилирования ДНК. Протеомный характеристика хроматина композиции в различных функциональных областях был до сих пор препятствует отсутствие эффективных протоколов, чтобы обогатить таких доменов на соответствующем чистоты и количества для последующего углубленного анализа методом масс-спектрометрии (МС). Мы описываем здесь недавно разработанный стратегию хроматина протеомики, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics), в результате чего препарат иммунопреципитация хроматина используется для изоляции различных регионов хроматина, чьи черты лица, с точки зрения hPTMs, варианты и со-связанные не-histonic белки, являются анализируют методом МС. Проиллюстрируем онре создание ChroP для обогащения и анализа транскрипционно молчащих гетерохроматиновых районов, отмеченной присутствии три-метилирования лизина 9 гистона H3. Результаты, достигнутые продемонстрировать потенциал ChroP в тщательно характеризующий гетерохроматина протеома и доказать это в качестве мощного аналитического стратегии понимания того, как различные белковые детерминанты хроматина взаимодействовать и объединения усилий для установления структурных и функциональных конфигураций Локус-специфичные.

Введение

Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов, который участвует в качестве основного шаблона для всех процессов ДНК-опосредованной. Нуклеосом является основным повторяется единицей хроматина и состоит из белкового октамерных ядра, содержащего две молекулы каждого канонического гистона H2A, H2B, H3 и H4, вокруг которого 147 п.о. из ДНК, обернутой 1,2. Все основные гистоны структуру шаровой области и гибкой N-терминальном "хвосте", которая выступает за нуклеосоме. Одним из основных механизмов для регулирования структуры хроматина и динамику основана на ковалентных пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы), которые в основном происходят на N-концах гистонов 3,4. Модификации гистонов может функционировать либо путем изменения структуры более высокого порядка хроматина, изменяя контактов между гистонов ДНК или между нуклеосом, и таким образом контролировать доступность ДНК-связывающих белков (цис механизмов), или действуя как dockinг сайты для регуляторных белков, либо в виде отдельных единиц, или встроенный в мультимерных комплексов. Такие регулирующие белки могут оказывать свою функцию по-разному: путем модуляции экспрессии гена непосредственно (то есть TAF белки), или путем изменения позиционированием нуклеосом (т.е. хроматина комплексов) или путем модификации гистонов другие остатки (т.е. белки с метил-трансферазы или ацетил- трансферазы) (транс механизмы) 5. Наблюдение, что отличие PTM модели кластера в конкретной хроматина локусов привела к разработке гипотезы, что различные модификации в отдельных площадках, могут скоординированных генерировать молекулярную код посредническую функциональное состояние подстилающей ДНК. "Гистонов код гипотеза" получила большой консенсуса в эти годы, но ее экспериментальная проверка была сдерживается техническими ограничениями 6,7.

Протеомика Масс-спектрометрия (МС) на основе сталамощный инструмент для сопоставления гистонов моделей модификации и охарактеризовать хроматина-связывающие белки 8. MS обнаруживает изменение в качестве конкретного Δmass между экспериментальной и теоретической массы пептида. На уровне отдельных гистонов, MS предоставляет непредвзятый и всесторонний метод для сопоставления PTMs, что позволяет обнаруживать новые модификации и выявление взаимодействий между ними 9-14.

В последние годы ряд стратегий были разработаны препарировать протеомный состав хроматина, в том числе характеристики нетронутыми митотических хромосом 15, идентификации растворимых hPTM-связывающих белков 16-18 и выделения и анализа конкретных регионах хроматина (т.е. теломеры) 19,20. Тем не менее, исследование локус-специфических синергии между гистонов PTMs, вариантов и ассоциированных с хроматином белков еще не завершен. Здесь мы описываем новый подход, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics) 21, которые мы разработали для эффективного характеризуют функционально различных доменов хроматина. Этот подход адаптируется иммунопреципитацию хроматина (чип), хорошо налаженные протокол, используемый в эпигенетической исследования, для эффективного МС на основе протеомики анализа обогащенного образца. Мы разработали две различные протоколы, в зависимости от типа хроматина, используемого в качестве входных данных и вопроса, адресованного МС; в частности: 1) чип нефиксированной родной хроматина переваренной MNase используется для очистки моно-нуклеосом и препарировать совместно, связывающие hPTMs (N-ChroP); 2) чип сшитого хроматина фрагментированы с помощью ультразвука используется в сочетании с SILAC основе interactomics стратегии, чтобы охарактеризовать все совместно обогащая хроматин-связывающих белков (X-ChroP). Проиллюстрируем здесь сочетание N-и X-ChroP для обогащения и изучения гетерохроматина, используя H3K9me3 в качестве приманки для шагов иммунопреципитации. Использование ChroP может быть продленучиться либо отдельные области на хроматина, или изменения в хроматина состава в пределах одного региона при переходе к другой функционального состояния, тем самым проложив путь к различным приложениям в эпигенетика.

протокол

1. Культура клеток

  1. Стандартный среда для родной ChIP
    1. Grow HeLa клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% глутамина, 1% Pen / Strep и 10 мМ HEPES рН 7,5.
  2. SILAC маркировки для сшивания ChIP
    1. Grow HeLa клетки в SILAC DMEM среде, обедненный из лизина и аргинина, с добавлением 10% диализованной FBS, 1% глутамина, 1% Pen / Strep, 10 мМ HEPES, рН 7,5 и либо легкой L-лизина (Lys 0) и L- аргинин (Арг 0) или их тяжелые коллеги, L-лизин (Lys 8) и L-аргинин (Арг 10) (Материалы Таблица), на конечных концентрациях 73 мг / л и 42 мг / л, соответственно.
    2. Рост клеток до восьми поколений в SILAC среды, чтобы обеспечить полное изотопно-закодированы аминокислоты включение. Pass клетки каждые два дня, когда они достигают плотность 1,0-1,5 × 10 6 клеток / мл, посев их в переменного токаoncentration из 3 х 10 5 клеток / мл.
    3. Оценка роста клеток и жизнеспособность в SILAC среды индивидуализировать любую возможную изменение от физиологии, которые могут возникнуть в результате бедной состава SILAC среды; сделать это:
      1. Осмотрите клетки морфологии у микроскопа каждый день в течение маркировки.
      2. Граф клеток и кривые роста участок клеток, растущих в SILAC против стандартной среде.

2. Родной хроматина Иммунопреципитация (N-чип)

  1. Ядра препарат из культивируемых клеток
    1. Используйте 1-2 х 10 8 немеченые HeLaS3 клеток на эксперименте. Урожай клеток, сделать аликвоты 50 х 10 6 клеток в 50 мл пробирки и центрифуги при 340 мкг в течение 10 мин при 4 ° С, промыть их ледяным PBS.
    2. Ресуспендируют осадок клеток каждый в 8 мл лизирующего буфера (табл. 1) и инкубируют в течение 10 мин при 4 ° С на вращающемся колесе. Налейте окrefully друг сотовой лизат на сахарозы (табл. 1) и центрифуги в колебательного ротора, в 3270 мкг в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы отделить ядра от цитоплазмы.
    3. Откажитесь супернатантов, держать ядерные гранулы и мыть их дважды в ледяной PBS путем центрифугирования, отбросить супернатант в каждой стирки.
  2. Микрококковой нуклеазы (MNase) пищеварение (малый масштаб) и контроль качества хроматина после переваривания
    1. Ресуспендируют осадок промывают ядерного в 1 мл буфера пищеварения (табл. 1); разделить на две аликвоты 500 мкл и держать на льду.
    2. Измерьте оптическую плотность (ОП) при 260 нм аликвоты, разбавляют 1:200 в 0,2% додецилсульфата натрия (SDS). Примечание: OD = 1 соответствует примерно 50 мкг / мл хроматина ДНК. Как правило, начиная с 2 х 10 8 клеток, OD находится в диапазоне 40-60.
    3. Возьмем 1% от ядер, добавьте MNase фермента до конечной концентрации 0.005 U фермента / мкл ядер и инкубировать при температуре 37 ° С в течение различных упущений времени (0, 10, 20, 40, 60 мин).
    4. В каждый момент времени, собирают 4 мкл переваренных ядер и добавить 1 мМ ЭДТА, чтобы остановить реакцию MNase. Держите на льду.
    5. Извлечение образцов ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки и элюируют их в 50 мкл ТЕ-буфера (табл. 1).
    6. Возьмем 20 мкл каждого образца ДНК, добавить 10 мкл загрузочного буфера (табл. 1) и загрузить образцы на 1% (вес / объем) агарозном геле, содержащем бромид этидия, с ПЦР-маркера в качестве контроля размера.
    7. Проверьте пищеварение оценивая хроматина нуклеосом лестнице произведенный MNase инкубации.
    8. Выбор оптимального времени для пищеварения, на основе распространенности моно-нуклеосом в препарате. . Обычно для 0,005 U фермента / мкл ядер оптимальное время MNase пищеварения на 60 мин (рис. 1В, левая панель) Примечание: Оптимальное MNase концентрация / время digestiна можно регулировать в зависимости от желаемого типа клеток и от размера нуклеосом участке.
  3. Large-scale/preparative MNase пищеварение и восстановление растворимых хроматина фракций
    1. Добавить к каждой аликвоте (см. 2.2.1) 5 мкл MNase, что соответствует конечной концентрации 0,005 U фермента / мкл ядер; аккуратно перемешать и инкубировать при 37 ° С в течение 60 мин (или вообще для оптимизированной промежуток времени, на основе теста малого масштаба).
    2. Добавить 1 мМ ЭДТА, чтобы остановить реакцию, и держать на льду. Гранул перевариваются ядра путем центрифугирования при 7800 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Перенесите супернатантов (фракция S1) в новую пробирку и хранить при 4 ° C. Примечание: S1 содержит первый растворимой фракции хроматина, включая моно-нуклеосом. Добавьте ингибиторы протеазы (табл. 1).
    3. Тщательно ресуспендирования гранул в 1 мл буфера для диализа (табл. 1) и диализировать в течение ночи при 4 ° С (Сут прочь диализа трубки составляет 3,5 кДа), в 3 л буфера для диализа, при постоянном умеренном перемешивании. Сбор диализу материал и центрифуги в 7800 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Передача супернатант (S2 фракция) в новую пробирку Эппендорф и хранить при температуре 4 ° C. Примечание: S2 включает ди-до епта-нуклеосом, в зависимости от пищеварения степени MNase.
  4. Контроль качества хроматина перед иммунопреципитацией
    1. Возьмем аликвоту, соответствующую 5 мкг S1 и S2 хроматина фракций (количественно, измеряя оптическую плотность при 260 нм в системе NanoDrop). Извлечение ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки и элюируют в 50 мкл ТЕ-буфера (табл. 1).
    2. Возьмем 20 мкл S1 и S2 ДНК, смешать с 10 мкл загрузочного буфера (табл. 1) и загружать их на 1% (вес / объем) агарозном геле. Проверьте качество и эффективность MNase пищеварения путем визуального осмотра нуклеосом лестнице Примечание:. Фракция S1 является высокообогащенный моно-нуклеосом, а доля S2 содержит в основном поли-нуклеосом (рис. 1В, правая панель).
  5. Инкубационный хроматина с антителом
    1. Хранить при -20 ° С 50 мкл фракции S1 для последующего анализа масс-спектрометрии.
    2. Добавить 1 объем ChIP Буфер для разведения (табл. 1), чтобы фракции S1.
    3. Добавьте антитела против hPTM (или белка), представляющие интерес; инкубировать в течение ночи на вращающемся колесе при 4 ° C. Примечание: Как правило, используют от 10 мкг до 20 мкг антитела на 2 х 10 8 клеток. Оптимальное соотношение между количеством антитела и исходного числа клеток должны быть тщательно установлено в каждом конкретном случае, в зависимости от избытка hPTM / белком, используемым в качестве приманки в образце и на эффективность антител. Оптимизация экспериментального, основаны на следующих тестов:
      1. Сравните количество hPTM / интересующего белка между входом и проточных (FT,см. 2.7.2) с помощью Вестерн-блоттинга или MS проверить, что иммунопреципитации обогащает значительную часть конкретной области хроматина. Примечание: Как правило, это достигается тогда, когда по крайней мере 50% от приманки hPTM / белок будет исчерпан в FT (рис. 1в) .
      2. Убедитесь, что иммунопреципитации интерес белок обнаруживается на SDS-PAGE гель, который гарантирует, что достаточное количество материала доступно для анализа MS. Примечание: наличие на геле полос, соответствующих четырех основных гистонов в правильной стехиометрии указывает, что нетронутыми нуклеосома была иммунопреципитировали на N-ChroP (Рисунок 1D). Отсутствие надлежащего стехиометрии, на самом деле, указывающего частичным разрушением / разворачивание нуклеосомы.
    4. Параллельно готовят белковые G-связанных магнитных шариков (см. п. 2.6).
  6. Уравновешивание и блокирование Белок G-связанных магнитных шариков
    1. Равновесие 100 мкл белка G-сочетании магнитные шарики суспензии в блокирующем растворе (таблица 1), трехкратной промывки и инкубации их в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе. Примечание: После связывающей способности гранул, используют 100 мкл суспензии для 2-20 мкг антитела.
    2. Вымойте заблокированные бусы раз блокирующим раствором и затем дважды ChIP Буфер для разведения (табл. 1).
  7. Выделение хроматина с использованием магнитных шариков
    1. Добавьте 100 мкл блокированных шариков к хроматина образца S1 и инкубировать их на вращающемся колесе при 4 ° С в течение 3 часов. Центрифуга при 340 мкг в течение 1 мин для замедления вращения образца от крышки советов. Положите в магнитном стойки для осаждения бусы.
    2. Передача супернатант в новую пробирку Эппендорфа. Это поток через (FT), а именно фракция хроматина, что не связывается с антителом.
    3. Вымойте бисером четырераз в промывочный буфер (табл. 1) увеличения концентрации соли в каждой стирки (75, 125 и 175 мм NaCl).
    4. Для элюирования иммунопреципитации хроматина, инкубировать бисером в 30 мкл буфера для образцов LDS, с добавлением 50 мМ дитиотреитола (DTT) в течение 5 мин при 70 ° С Отдельные элюированных белков на 4-12% Bis-Tris акриламид SDS-PAGE сборного градиентном геле и окрашивают гель с окрашиванием Кумасси комплект (рис. 1D).

3. Сшивание хроматина Иммунопреципитация (X-чип)

  1. Сшивание клеток с формальдегидом
    1. Добавить 0,75% формальдегида в SILAC-меченых клеток, кратко перемешать и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Гасят формальдегид добавлением 125 мМ глицина и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Разделите клетки в 5 х 10 7 аликвоты; промойте их три раза с ледяным PBS путем центрифугирования при 430мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбрасывания супернатантов после каждой промывки. В последней промывки отбросить супернатант и держать шарик. Примечание: После того, как клетки являются сшитыми, они могут храниться при -80 ° С, если не использовали немедленно.
  2. Ядра подготовка
    1. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 10 мл лизирующего буфера (табл. 1). Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С с вращением. Центрифуга при 430 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов; держать ядерные гранулы.
    2. Ресуспендируют каждый ядерный осадок в 10 мл промывочного буфера (табл. 1). Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин на вращающемся колесе.
    3. Центрифуга при 430 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов и собирать шарики.
    4. Ресуспендируют каждый ядерного гранул в 3 мл ChIP инкубационном буфере (табл. 1). Держите на льду.
  3. Хроматина ультразвуком и контроль качества
    1. Разрушать ультразвуком ч. romatin на 200 Вт (циклы 30 сек "на" и 1 мин "выключено"), в охлажденном Bioruptor, чтобы фрагмент хроматин Примечание: количество циклов и ультразвуком интервалы зависит от типа клеток и от средней длины нуклеосомной растянуть лучшего. Как правило, 30 мин ультразвуком необходимы для генерации фрагментов ДНК 300-500 п.н. длины, соответствующей ди-и три-нуклеосом. Выбор размера фрагментов зависит от типа домена хроматина исследуемого.
    2. Возьмем 2% от общего ввода в обратном сшивание путем инкубации при 65 ° С в течение как минимум 1 ч чип инкубационном буфере. Извлечение ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки, элюирования в 50 мкл ТЕ буфера и загружать ДНК на геле агарозы, чтобы проверить фрагментацию хроматина.
  4. Инкубационный хроматина с антителом
    1. Добавить 1/10 объема 10% Triton X-100 в ультразвуком хроматина. Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения деБрис.
    2. Сохранить 50 мкл хроматина ввода от тяжелых клеток для тестирования уровня включения SILAC аминокислот в меченых клеток и для профилирования белка.
    3. Добавить антитело выбора для оставшейся тяжелой и легкой меченого ультразвуком хроматина и инкубировать в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе. В светового канала, добавить также избыточное раза растворимого пептида. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе Примечания:. Оптимальное состояние между мкг антитела и исходного материала клеток выбирается в каждом конкретном случае, как описано в 2.5.3. Оптимальное избыток раза молярность растворимого пептида в отношении антитела должны быть тщательно титруют в каждом конкретном случае.
  5. Выделение хроматина с использованием магнитных шариков
    1. Равновесие и блокировать белок G-связанных магнитных шариков, следуя инструкциям, описанным в 2.6 и используя обломок инкубационного буфера.
    2. Добавить 100 мкл заблокированных бEADS к образцам хроматина и инкубировать на вращающемся колесе в течение 3 ч при 4 ° С. Центрифуга при 340 мкг в течение 1 мин для замедления вращения образца от крышки советов. Положите в магнитном стойки для осаждения бусы. Верхний слой является поток через (FT), содержащий несвязанных нуклеосом. Вымойте бисером четыре раза в промывочный буфер (табл. 1) с увеличением концентрации соли (два моет при 150 мм и два 300 мм NaCl).
    3. Инкубировать бусины в 30 мкл SDS-PAGE Загрузка буфере для образцов (табл. 1) и в течение 25 мин при 95 ° С и к элюата и де-сшивки иммунопреципитированных белков. Отдельные белки на 4-12% Bis-Tris акриламида SDS-PAGE гелей сборных (рис. 3D).

4. Подготовка образцов Перед МС

  1. В гель пищеварения гистонов обогащенных от N-Chip
    Примечание: Во время переваривания белков и извлечения пептид шаги заботитьсясвести к минимуму кератиновых загрязнений, которые мешают LC-MS/MS, как описано выше 22, 23.
    1. Ломтики Cut гель соответствующие стержневых гистонов полос (рис. 1D). Де-Пятно гель штук с 50% ацетонитрила (ACN) в DDH 2 O, чередующихся с 100% ACN сокращаться гель. Повторяйте до тех пор гели части не полностью де-окрашенных и высушите их в вакуумной центрифуге.
    2. Добавить D-6 уксусного ангидрида 1:9 (объем / объем) в 1 М бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3) (как правило, конечный объем составляет 60-100 мкл) и 3 мкл ацетата натрия (CH 3 COONa), как катализатор. Выдержите в течение 3 ч при 37 ° С с сильным сотрясением Примечание:. Образец может образования пузырьков в самых первых минут после сборки реакции: это важно обращаться с осторожностью и отпустите газа, образованного, открытие время от времени трубок во время инкубации.
    3. Промойте гель части несколько раз жIth NH 4 HCO 3, чередуются с ACN на повышение процента (от 50% до 100%), с тем чтобы полностью удалить остатки 6-уксусным ангидридом D.
    4. Термоусадочная куски геля в 100% ACN; высушить их в вакуумной центрифуге, чтобы обеспечить полное де-гидратации. Re-гидрата штук гель с ледяной 100 нг / мкл раствора трипсина в 50 мМ NH 4 HCO 3 и инкубировать в течение ночи при 37 ° C. Примечание: Сочетание химической модификации лизинов использованием дейтерированный уксусного ангидрида и трипсина пищеварение генерирует "Арг- C нравится "в гель пищеварения картины гистонов 21,24.
    5. Откажитесь от избытка раствора и добавить объем 50 мМ NH 4 HCO 3, чтобы полностью покрыть кусочки геля; инкубировать в течение ночи при 37 ° С
    6. Сбор растворимые переваривается пептиды в новую пробирку Эппендорф. Лиофилизировать пептиды. Ресуспендируют их в 0,5%-ной уксусной acid/0.1% трифторуксусной кислоты (TFA). Опреснения и сосредоточитьсяпептиды на обращенной фазой C 18 / Карбон "сэндвич" и ионообменной хроматографии (SCX) на ручной микроколонках (StageTip) 25.
    7. Подготовьте StageTip Микроколонки, поставив тефлоновые сетчатая структура диски, содержащие иммобилизованные C 18 / Carbon ("сэндвич") и бусы SCX в 200 советов мкл. Получить «сэндвич» по загрузке C 18 микроколоночный на вершине второй наконечник с грузом Угольный фильтр. Примечание: очень короткие пептиды, которые не были предложены на C 18 фильтра, проходят в проточных, который загружается непосредственно на Углерод Совет, который обычно захватывает их. SCX StageTips может обогатить специфические пептиды, такие как H3 (3-8) пептид, не эффективно сохранены хроматографией с обращенной фазой.
    8. Нагрузка 50% пептидов на C 18 / Carbon "сэндвич StageTip" и 50% на SCX StageTips. Элюции их от Советы C 18 / углерода с использованием 80% ACN/0.5% уксусной переменного токаID и из SCX советы с 5% гидроксидом аммония (NH 4 OH) / 30% метанол. После лиофилизации, ресуспендируйте пептидов в 0,1% FA и анализировать по LC-MS/MS.
  2. В геле Переваривание иммуноочищенного белков
    В гель-переваривание белков проводили, как описано ранее 22, с незначительными изменениями.
    1. Разрежьте каждый переулок в десять ломтиками (рис. 3D) и каждый кусочек в мелких кубиков 1 мм 3. Де-Пятно гель штук с 50 мм NH 4 HCO 3/50% этанола и добавить абсолютный этанол сокращаться гели. Повторяйте до тех пор гели не являются полностью де-окрашенных.
    2. Добавить буфер уменьшения (табл. 1) на куски геля в течение 1 часа при 56 ° С с последующим добавлением алкилирующего буфера (табл. 1) в течение 45 мин при комнатной температуре, в темноте. Вымойте и высушите геля штук в вакуумной центрифуге.
    3. Увлажняет куски геля с ледяной 12,5 нг / мкл трипсина зольution в 50 мМ NH 4 HCO 3 и инкубировать на льду до полного регидратации гелевых штук. Удалить трипсин в избытке.
    4. Добавить 50 мМ NH 4 HCO 3, чтобы полностью покрыть кусочки геля. Выдержите в течение ночи при 37 ° С
    5. Сбор жидкую часть. Добавьте буфера для экстракции (табл. 1), чтобы гелевых штук; инкубировать с сильным перемешиванием в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите два раза.
    6. Инкубируйте кусочки геля в ACN в течение 10 мин с сильным перемешиванием. Повторите два раза и объединить все супернатанты.
    7. Лиофилизации пептиды. Ресуспендируют высушенные пептидов в 0,5% уксусной acid/0.1% TFA.
    8. Опреснения и сосредоточиться пептиды на обращенной фазой С 18 StageTip, как описано 26, 27.
    9. Элюции пептидов с С 18 StageTip с использованием 80% ACN/0.5% уксусной кислоты. Удаления органического растворителя путем выпаривания в вакуумной центрифуге и ресуспендируют пептидов в 0,1% FA (обычно 5-10 &# 181; л), когда будете готовы к анализу MS.

5. ЖХ-МС анализ

  1. Жидкостного хроматографического анализа
    1. Пакет аналитическую колонку в 15 см кварцевой эмиттера (внутренний диаметр 75 мкм, 350 мкм внешний диаметр), с использованием обращенной фазой (RP) C 18, 3 мкм смолы в метаноле при постоянном давлении гелия (50 бар) с помощью бомба-погрузчик устройство, как описано выше 28.
    2. Пара упакованы излучатель (C 18 RP колонка) непосредственно на выходе из 6-порт клапана ВЭЖХ через 20-см длиной (внутренний диаметр 25 мкм) плавленого кварца без использования перед колонкой или разделить устройство.
    3. Загрузите перевариваются пептиды в C 18 колонки RP в потоке 500 Нл / мин подвижной фазы А (0,1% ФА / 5% ACN в DDH 2 O).
    4. После загрузки образца, отделить пептиды, используя следующие градиенты:
      1. Применение 0-40% подвижной фазы В (0,1% FA/99% ACNв DDH 2 O) при 250 нл / мин в течение 90 мин с последующим градиентом 40-60% в течение 10 мин и 60-80% в течение 5 мин, дл элюировани пептидов, вытекающих из гистонов (см. 2).
      2. Применение 0-36% подвижной фазы В при 250 Нл / мин более чем 120 минут с последующим градиентом 36-60% в течение 10 мин и 60-80% в течение 5 мин, дл элюировани пептидов, вытекающих из иммунологически белков (см. 3).
  2. Масс-спектрометрия анализ с использованием LTQ-FT-ICR-Ультра масс-спектрометра
    1. Эксплуатация в сбора данных в зависимости от режима (ДВР), чтобы автоматически переключаться между МС и приобретения MSMS. MS полный спектр сканирования приобретаются, как правило, в диапазоне м / г от 200-1,650, приобретается с разрешением R = 100000 при 400 м / г. Пять (TOP5) наиболее интенсивные ионы изолированы фрагментации в линейной ионной ловушки с использованием индуцированные столкновениями диссоциации (CID) на целевой величины 5000.
    2. Используйте параметры, перечисленные в таблице 2 FOг "Тюнинг" Приобретение файл.
    3. Установить стандартные настройки приобретения, которые перечислены в таблице 2.

6. Анализ данных

  1. Этикетка бесплатно количественное модификаций гистонов совместно обогащенных доменов хроматина
    1. Преобразование приобретенные сырье файлы MGF файлов с помощью программного обеспечения Raw2msm (версия 1.10) 29.
    2. Поиск модификации гистонов, используя талисмана демон (версия 2.2.2), настройка параметров, описанных в таблице 3.
    3. На выходе списке пептидной талисман, удалить пептиды с счетом ниже, чем 15 или с более чем 5 предполагаемых PTMs 29 Примечание:. Для каждого отдельного пептида ID, выберите пептид с наибольшим количеством очков талисман и отфильтровать все другие избыточные пептиды с таким же ID .
    4. Построить извлеченные ионные хроматограммы (XIC) для каждого предшественника, соответствующего каждые модифицированных пептидов, барельефред от величины м / г, используя QualBrowser. Вычислить площадь под кривой (AUC) для каждого пика (рис. 2а).
    5. Подтвердить каждого идентифицированного пептиды, содержащие изменения от визуального осмотра спектров MS / MS, использующих QualBrowser (рис. 2б).
    6. Рассчитать относительное содержание для каждого модифицированного пептида. Вычислите относительную обогащение каждого изменения в чипе-е изд материала Примечание:. Относительная численность рассчитывается как соотношение между AUC каждого конкретного модифицированного пептида над суммой AUC всех модифицированных и немодифицированных форм одного и того же пептида, в то время как относительная обогащение как отношение относительного содержания конкретной модификации в чипе, над сигналами (рис. 2С).
  2. Количественный протеомный анализ белков совместно связаны в доменов хроматина
    1. Для белков идентификации и количественного использовать пакет MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Настройте встроенную поисковую систему "Андромеда", используя AndromedaConfig.exe 31 и установите параметры поиска, перечисленные в таблице 3.
  3. Тест Включение
    1. Оцените степень включения тяжелых аминокислот в белках в тяжелой меченных ввода хроматина, используя MaxQuant программного обеспечения, а именно:
      1. Установите параметры, как описано в 6.2, но отключение режим повторной количественной.
      2. Рассчитать процент инкорпорации применяя следующую формулу для неизбыточных отношений пептидных:. Объединение (%) = соотношение (Н / L) / соотношение (В / Н) + 1 × 100 (рис. 3В) Примечание: Принимаем только если включение> 95 %.

Результаты

Иммунопреципитации хроматина является мощным средством используется для профилирования локализацию белка или модификации гистонов вдоль генома. В протеомики эквиваленте, чип следует протеомики MS основе определить качественно и количественно в hPTMs, варианты гистонов и хроматина-свя...

Обсуждение

Мы недавно описал ChroP, количественную стратегию масштабного характеристики белковых компонентов хроматина. ChroP сочетает в себе два взаимодополняющих подходов, используемых в эпигенетической области, Чип и магистра, прибыль от их сильных и преодоления их соответствующие ограничения. ?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Это исследование было впервые опубликована в Mol Cell протеомики. Soldi М. и Bonaldi Т. Протеомный Исследование хроматина функциональных областей показывает Novel синергизм среди Отдельное гетерохроматина Компоненты MCP. 2013; 12: 64-80. © Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Мы благодарим Роберта Noberini (Итальянский технологический институт и НОО, Италия) за критическое прочтение рукописи. Работа ТБ поддерживается грантами Armenise Гарвард-Foundation Программы Джованни Career Development, итальянской ассоциации по исследованию рака и Министерства здравоохранения Италии. MS Работа выполнена при поддержке стипендии FIRC.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

Ссылки

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

86hPTMsSILACchromatomehPTMs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены