Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

Резюме

В пробирке тесты для измерения репликацию вируса были значительно улучшены по разработке рекомбинантных РНК-содержащих вирусов, экспрессирующих люциферазы или другие ферменты, способные биолюминесценции. Здесь мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровод, который сочетает в себе такие рекомбинантных штаммов кори и Чикунгунья вирусов изолировать противовирусные препараты широкого спектра действия из химических библиотек.

Аннотация

РНК-вирусы несут ответственность за крупных заболеваний человека, таких как грипп, бронхит, лихорадка денге, гепатит С или кори. Они также представляющих собой растущую угрозу из-за увеличения мировых биржах и человеческих популяций, проникающих все больше и больше природных экосистем. Хорошим примером такого складывающейся ситуации является вирус чикунгунья эпидемии 2005-2006 в Индийском океане. Последние достижения в понимании клеточных путей, контролирующих репликацию вируса предполагают, что соединения, нацеленные функции клетки-хозяина, а не сам вирус, может ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. Некоторые широкого спектра противовирусных соединений были идентифицированы с принимающими целевых анализов. Однако измерения ингибирования репликации вируса в клеточных культурах, используя снижение цитопатического эффекта в качестве отсчета все еще представляет первостепенную стратегию скрининга. Такие функциональные экраны были значительно улучшены по разработке рекомбинантных вирусов, экспрессирующих ферментами-репортерами окpable биолюминесценции, таких как люциферазы. В настоящем докладе мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровода, который сочетает в себе рекомбинантные кори и Чикунгунья вирусы с сотовой жизнеспособность анализов, для идентификации соединений с широким спектром противовирусной профиля.

Введение

РНК-вирусы несут ответственность за большое разнообразие человеческих инфекций, и имеют огромное влияние на популяции во всем мире как с точки зрения общественного здравоохранения и экономичной цене. Эффективные вакцины были разработаны против нескольких вирусов человеческого РНК, и широко используются в качестве профилактического лечения. Тем не менее, все еще существует критическая нехватка лекарственных препаратов против вирусных РНК инфекций. Действительно, эффективные вакцины не доступны по отношению к основным человеческих патогенов, таких как вирус денге, вирус гепатита С или вируса человеческого респираторного синцитиального (РСВЧ). Кроме того, РНК-вирусы несут ответственность за большинством возникающих болезней, которые увеличили частоты из-за глобальных обменов и антропогенного воздействия на экологические системы. Против этой угрозы, которые представляют РНК-содержащих вирусов, наш терапевтический арсенал крайне ограничен и относительно неэффективны ^1-3. Современные методы терапии в основном на основе рекомбинантного типа I интерферонов (ИФН-α / β), чтобы стимулировать врожденный иммунитет,или администрация рибавирином. Хотя механизм действия этого рибонуклеозид аналоговых является спорным и, вероятно, используются различные механизмы, ингибирование клеточного IMPDH (инозинмонофосфатдегидрогеназы), который истощает внутриклеточные бассейны GTP, явно необходимы ^4. Рибавирин, в сочетании с пегилированного интерферона-α, является основным лекарственным средством против вируса гепатита С.. Тем не менее, ИФН-α / β и рибавирина процедуры относительно плохой эффективности в естественных условиях по отношению к большинству РНК-содержащих вирусов, поскольку они эффективно тупые ИФН-α / β сигналов через выражение факторов вирулентности ⁵ и часто избежать рибавирин ^3. Это добавило к тому, что лечение рибавирин повышение важные вопросы, связанные с токсичностью, хотя был недавно одобрен против тяжелой болезни РСВЧ с спорные преимущества ^6. В последнее время некоторые вирус-специфических методов лечения, поступающие в продажу, в частности, против вируса гриппа с разработкой Oе ингибиторы нейраминидазы ^3. Тем не менее, большая разнообразие и постоянное появление РНК-содержащих вирусов препятствует развитию конкретных обработок против каждого из них в относительно недалеком будущем. В целом, это подчеркивает необходимость эффективных стратегий для определения и разработки мощных противовирусных молекул в ближайшем будущем.

Это тривиально, чтобы сказать, что ингибитор широкого спектра активен в отношении большого панели РНК-содержащих вирусов бы решить эту проблему. Хотя такая молекула-прежнему мечта вирусолог, наша лучшее понимание клеточных защитных механизмов и врожденной иммунной системы предполагают, что некоторые возможности существуют ^7,8. Несколько академических и промышленных лабораторий в настоящее время ищет молекулы, которые стимулируют конкретные аспекты сотовой защитных механизмов или метаболических путей притупить репликацию вируса. Хотя такие соединения, вероятно, покажут значительные побочные эффекты, лечения от острых вирусных инфекций будет Администрированиеред в течение относительно короткого времени, что делает их приемлемыми, несмотря на некоторые потенциальной токсичности на долгосрочной перспективе. Различные стратегии были разработаны для выявления таких широкого спектра противовирусных молекул. Некоторые исследовательские программы направлены на поиск молекул, которые ориентированы на конкретные оборонные или метаболических путей. Это включает в себя, например, рецепторы распознавания патогена, чтобы вызвать экспрессию гена противовирусного ⁹ и активируют противовирусные такие факторы, как RNaseL ^10, аутофагии машин для содействия деградации вирусного ^11, нуклеозид синтез дорожками ^12,13, или апоптоза каскадов, чтобы осадить гибель инфицированных вирусом клеток ^14. Другие группы разработали фенотипические экраны, которые не являются целевыми, основанные ^13,15-17. В этом случае, противовирусные молекулы просто идентифицировать по их способности блокировать вирусную репликацию в данной сотовой системой. Общее предположение, что соединение, ингибирующее 2-3 несвязанных вирусов РНК будет иметь подходящий профиль для широкого-SPectrum противовирусной молекуле. Механизм действия хит соединений, выбранных с таким эмпирического подхода определяется только во второй раз и в конце концов, может привести к идентификации новых клеточных мишеней для противовирусных препаратов. Интересно, что ретроспективный анализ новых лекарств, одобренных в США продуктов питания и медикаментов в период между 1999 и 2008 показал, что в общем, такие фенотипические показы, как правило, работают лучше, чем целевых подходов, чтобы обнаружить первый в своем классе низкомолекулярные препараты ¹⁸ .

Репликация вируса в клеточной основе анализов высокой пропускной обычно определяется от вирусных цитопатических эффектов. Клетки инфицируют и культивировали в 96 - или 384-луночных планшетах в присутствии тестируемых соединений. После нескольких дней, клеточные слои фиксировали и окрашивали красителей, таких как кристаллическим фиолетовым. Наконец, поглощение определяется с читатель пластины и соединения, ингибирующие репликацию вируса идентифицируются по их способности хранить клеточные слои сюдам вирус-индуцированной цитопатического эффекта. Кроме того, вирусно-опосредованного цитопатические эффекты оценивали с использованием стандартных анализов жизнеспособности таких как снижение МТС. Такие анализы очень сговорчивым и экономически эффективным, но страдают от трех основных ограничений. Во-первых, они требуют сочетания вирус-клеток, где вирусной репликации цитопатический всего несколько дней, но это не всегда возможно, тем самым призывая к альтернативных подходов ^19. Во-вторых, они плохо количественный, так как они основаны на косвенной мерой репликации вируса. Наконец, токсичных соединений может быть оценивали как положительные ударов, и, следовательно, должны быть устранены с противоположным экране измерения жизнеспособности клеток. Для преодоления некоторых из этих препятствий, рекомбинантные вирусы или репликоны были разработаны методом обратной генетики выразить репортерных белков, таких как EGFP или люциферазы, от дополнительного блока транскрипции или в рамке с вирусных генов белка (Несколько примеров ^20-23). Когда эти репликации вирусов, репортер пр.oteins производятся вместе с самими вирусных белков. Это обеспечивает очень количественного анализа для измерения вирусной репликации и оценки ингибирующей активности молекул-кандидатов. Это особенно верно для рекомбинантных вирусов, экспрессирующих люциферазы (или другие ферменты, способные биолюминесценции), поскольку это репортер система демонстрирует широкий динамический диапазон с высокой чувствительностью и практически без фона. Кроме того, нет никакого источника света возбуждения, тем самым предотвращая помехи с соединением флуоресценции ^24.

Здесь мы подробно протокол высокой пропускной экранировать химические библиотеки для ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Соединения проверяются сначала на клетках человека, инфицированных рекомбинантным вирусом кори (MV), выражающей люциферазы светляков ²⁵ (rMV2/Luc, рисунок 1, основной экран). М.В. принадлежит Mononegavirales заказ, и часто рассматривается как прототип члена отрицательной нить РНК вирусаэс. Таким образом, MV геном использовали в качестве матрицы с помощью вирусной полимеразы синтезировать мРНК, кодирующих вирусные белки. В рекомбинантного MV деформации под названием rMV2/Luc, люциферазы выражение выражается от дополнительного блока транскрипции вставленной между Р и М генов (рис. 2А). Параллельно соединения тестировали на их токсичности на клетках человека с помощью коммерческого люциферазы на основе реагента, который оценивает, АТФ количественного количество метаболически активных клеток в культуре (рис. 1, первичный экран). Целые химические библиотеки могут быть легко скринировали с этих двух анализах с целью выбора соединений, которые не токсичны и эффективно блокируют репликацию MV. Затем хиты повторно для ингибирования доза-реакция М.В. репликации, отсутствие токсичности, а также для их способности ухудшать вирус чикунгунья (CHIKV) репликации (рис. 1, среднее экрана). CHIKV является членом Togaviridae семьи и ее геном апOsitive однонитевую молекулу РНК. Как таковая, она не имеет никакого отношения к кори и соединений, ингибирующих и М.В. и CHIKV стоять большой шанс ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. CHIKV неструктурные белки непосредственно в переводе с вирусного генома, тогда как структурные белки кодируются транскрипции и трансляции в субгеномной молекулы мРНК. Наша Анализ in vitro репликации для CHIKV основана на рекомбинантного штамма называемой CHIKV / Ren, выражающего фермента люциферазы Renilla как расщепленной части неструктурного полипротеина посредством введения гена-репортера между nsP3 и NSP4 последовательностей ²⁶ (фиг. 2B). Мерой активности люциферазы Renilla позволяет контролировать вирусной репликации на ранней стадии CHIKV жизненного цикла.

Этот протокол высокой пропускной был использован для быстрой идентификации соединений с подходящим профилем для противовирусных препаратов широкого спектра действия в коммерческом библиотеке 10000 MolecULES обогащенные для химической разнообразия. Соединения существу, следуя правилу Липинский в пяти, с молекулярной массой от 250 до 600 дальтон и регистрации значений D ниже 5. Большинство из этих молекул были новые химические соединения, недоступные в других коммерческих библиотек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Плиты Дочерние 96-а с соединений

1. Перемещение матери 96-луночных планшетах, содержащих 10 мМ исходные растворы химических соединений в ДМСО от -20 ° С до комнатной температуры. Разреженного соединения 5x в ДМСО для получения промежуточных пластин разбавления 96-а при 2 мм. Разбавление достигается с помощью пипетки 5 мкл в 20 мкл ДМСО и смешивания.
2. Внесите 1 мкл от разбавления пластин в сухие лунки белый, со штрих-кодом для культивирования тканей 96-луночных планшетах. Этот первый набор дочерних пластинок (D1) будет использоваться для оценки токсичности соединений в конечной концентрации 20 мкМ. Магазин дочерних планшетах при -20 ° С до использования.
3. Развести соединений снова 1:10 с помощью пипетки 4 мкл разведений из пластин в 36 мкл ДМСО и смешивания. Внесите 1 мкл в сухие лунки белый, плоским дном, штрих-кодом культуре ткани 96-луночных планшетах. Это второй набор дочерних пластинок (D2) будет использоваться для оценки ингибирования М.В. replicatioн соединениями при конечной концентрации 2 мкМ. Магазин дочерних планшетах при -20 ° С до использования.

2. Подготовка клеточных культур, чтобы определить соединение Токсичность

1. Grow НЕК-293Т при 37 ° С и 5% СО ₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с стабилизированной L-глутамина и дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), стрептомицин (100 мкг / мл) и пенициллин (100 МЕ / мл). Клетки пассируют обработкой трипсином каждые 4-5 дней, и разводили 1:10 в свежем колбу. Клетки должны быть в логарифмической фазе для экспериментов.
2. В день эксперимента, восстановить клетки путем обработки трипсином и выполнять подсчет клеток. Гранул клетки центрифугированием и ресуспендируют их в 3 х 10 ⁵ клеток / мл в культуральной среде. Учтите, что 12,5 мл клеточной суспензии требуются для каждого скрининга пластины.
3. Передача клетки корыте, и 100 мкл клеточной суспензии в D1 пластины, содержащие шипами химический компоunds. Сотовый подвеска в корыто регулярно перемешивают, чтобы избежать оседания.
4. Spike Контрольные лунки A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 и G12 с 1 мкл ДМСО. Соответствующие скважины будет использоваться в качестве ссылки для живых клеток (без токсичности). Spike Контрольные лунки B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 и H12 с 1 мкл ДМСО и 2,5 мкл 0,5% раствора IGEPAL, чтобы убить клетки. Соответствующие скважины будут использоваться в качестве основы для мертвых клеток (высокая токсичность).
5. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО _2.

3. Подготовка клеточных культур, зараженных rMV2/Luc

1. Расти и восстановить клетки, как описано в 2.1 и 2.2. Опять же, ресуспендирования клеток на 3 х 10 ⁵ клеток / мл в культуральной среде. Учтите, что 12,5 мл клеточной суспензии требуются для каждого скрининга пластины.
2. Дополнительно: добавка культуральной среды с уридина при 20 мкг / мл.
   Примечание: При скрининге химические библиотеки для вирусной replicatioн ингибиторы, кажется, что соединения, направленные на ранние этапы пиримидинового биосинтеза часто изолированы ^13,16,27,28. Добавление уридина в культуральной среде используется, чтобы отфильтровать такие противовирусные молекулы. В самом деле, это эффективно восстанавливает репликацию вируса, когда вверх по течению ферменты пиримидинового биосинтеза заблокированы.
3. Сохранить 1:10 клеточной суспензии для контроля скважин с неинфицированных клеток, и перейти к инфекции с остального объема.
4. Оттепель соответствующий объем rMV2/Luc маточного раствора. Растворы MV, как правило, на 10 ⁶ -10 ⁸ инфекционных частиц на мл. Культура должна быть инфицированы 0,1 инфекционных частиц rMV2/Luc в клетках-мишенях, что соответствует 0,1 множественности инфекции (MOI). Примечание: rMV2/Luc происходит от MV вакцины (штамм Schwarz) и манипулируют в среде BSL2.
5. Добавить вирус клеточной суспензии и аккуратно перемешать. Трансфер инфицированные клетки к корыту, и обойтись 100мкл зараженной клеточной суспензии в колонках 2 до 11 из D2 пластины, содержащие шипами химических соединений. Сотовый подвеска в корыто регулярно осторожно перемешивают.
6. В колонках 1 и 12, 100 мкл неинфицированных клеток а на два. Зараженные клетки распределяют в другие скважин.
7. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО _2.

4. Меры активность люциферазы и анализа данных

1. Удалить D1 пластины из инкубатора, и определить жизнеспособность клеток путем добавления 50 мкл люциферазы основе жизнеспособности реагента непосредственно в культуральных лунок. Перемешать, инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Читайте таблички с люминометре. Время интегрирования установлена ​​на уровне 100 мс на лунку.
2. Удалить D2 пластины из инкубатора, и определить активность люциферазы добавлением 50 мкл субстрата люциферазы непосредственно в культуральных лунок. Инкубировать в течение 6 мин при комнатной температуре, и читать пластины с помощью люминометра, как descriкровать выше.
3. Вычисление Z 'фактор для каждого D1 пластины токсичности анализа, чтобы гарантировать качество экрана ^29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), где μ + и σ + соответствуют помощью люминесценции и стандартных отклонений для НЕК-293Т с только ДМСО (без токсичности), и μ-и σ-это средства люминесценции и стандартных отклонений для культуры скважин, обработанных Igepal убить клетки. Z 'как ожидается, будет выше 0,5, или из соответствующего пластина отбрасывается.
4. Установить порог токсичности при μ + / 2. Откажитесь соединения со значениями люминесценции ниже этой отсечки (рис. 3А).
5. Вычислить Z 'фактор для каждого D2 пластины противовирусного анализа. Здесь μ + и σ + соответствуют помощью люминесценции и стандартные отклонения для инфицированных клеток, культивированных с одним только ДМСО, и μ-и σ-являются средством люминесценции и стандартные отклонения для неинфицированных клеток. Опять же, плиты с Z & #39; значения ниже 0,5 отбрасываются.
6. Рассчитайте ингибирование вирусной репликации следующим образом: процент ингибирования = (μ + - активность люциферазы для соединения X) / (μ + - μ-) * 100. Установить порог ингибирования на 75%, и выберите соединения, которые как сокращают значения люминесценции ниже этого отключения (рис. 3В) и не являются токсичными в соответствии с критериями, описанными в 4.4.

5. Вторичный экран для токсичности и широкого спектра противовирусной активности

1. Убедитесь, 1:02 серийные разведения для каждого удара соединения в ДМСО, начиная с 500 мкм до 4 мкм (8 разведений). Заполните белый, планшеты для тканевых культур штрих-кодом с 50 мкл культуральной среды. Добавить 1 мкл каждого разведения соединения в культуре скважин. Повторите дважды, чтобы иметь 3 культуру, живущую с одинаковыми серийными разведениями для каждого хита соединения.
2. Подготовка 37,5 мл клеточной суспензии НЕК-293T в 6 х 10 ⁵ клеток / мл в культуральной среде, как описано выше (в 2,1 и 20,2). Внесите 2x 12,5 мл в сокола труб и инфицировать клетки либо rMV2/Luc в МВД = 0,1 или рекомбинантный CHIKV выражая Renilla люциферазу (CHIKV / Ren) в МВД = 0,2. Смешайте путем обращения.
   Примечание: CHIKV / Ren происходит от дикого типа штамма CHIKV и, следовательно, должны манипулировать в среде BSL3. Пластины могут быть перемещены из BSL3 в BSL1 раз Renilla подложка была добавлена ​​к культуре скважины (см. ниже).
3. Внесите 50 мкл неинфицированных, rMV2/Luc-infected или CHIKV / Рен-инфицированных клеток в культуре пластины, содержащие серийные разведения хит соединений. Выдержите 24 ч при 37 ° С
4. Добавить 50 мкл светлячка субстрата люциферазы определить светлячка активность люциферазы в rMV2/Luc-infected скважин. Добавить 50 мкл Renilla субстрата люциферазы для определения активности люциферазы Renilla в CHIKV / Рен-инфицированных скважин. Наконец, добавить 50 мкл люциферазы основе анализа жизнеспособности реагента в неинфицированных клетках, чтобы определить клеточную жизнеспособность.
5. Данные земля (FiGure 4) и определить, пострадавших концентрации составных, которые препятствуют MV и CHIKV репликации на 50%. Не обращайте внимания соединение, отображающее некоторую токсичность в этом анализе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот скрининг трубопровода зависит в первую очередь от выбора соединений, которые ингибируют MV репликацию и не показывают существенного клеточную токсичность (рис. 1, основным экраном). Он использует люциферазной основе анализов, чтобы определить клеточную токсичность и инги...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Скрининг трубопровода описано здесь направлена ​​на выборе соединения с подходящим профилем в качестве ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Когда библиотека 10000 соединений был показан с этим протоколом и вышеупомянутые критерии фильтрации были применен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.