JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Аннотация

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Введение

В этом протоколе, мы опишем эффективные методы для подавления генов в линиях мыши макрофагов клеток, используя миРНК и мониторинга последствий такого лечения на врожденного иммунного ответа. Эти процедуры выполняются в формате 96-луночного, что позволяет РНК-интерференции экраны в средне- или высокой пропускной моды.

В ответ на инфекцию, люди монтировать немедленного врожденный иммунный ответ и более медленный, но более конкретные адаптивного иммунного ответа. Этот быстрый врожденного иммунного ответа включает вербовку и активацию фагоцитирующих врожденных иммунных клеток, включая макрофаги 1. Классически активированные макрофаги участвуют в острых воспалительных реакций и производить антибактериальных белков и соединений, цитокинов и хемокинов, и представить антигены 2,3. Кроме того, активированные макрофаги играют роль в регуляции иммунитета, поддержания толерантности, восстановление тканей и заживление ран 4-8. Из-за их широкого спектра функций, Макрофаги могут играть определенную роль в многочисленных заболеваний, включая атеросклероз, артрит, рак и 9. Таким образом, изучение макрофагов является ключевым направлением исследований в течение некоторого времени в самых разнообразных областях заболевания.

Несмотря на их важность в врожденного иммунного ответа, макрофаги могут быть сложные клетки, чтобы работать с. В частности, трудно получить эффективную трансфекцию с использованием липидных реактивов в макрофагах без ассоциированного токсичности 10,11. Более того, даже когда миРНК эффективно доставлены в макрофагах, надежность RNAi-индуцированного гена нокдаун часто может быть довольно умеренными и могут варьироваться в зависимости от гена к гену.

Чтобы преодолеть эти технические проблемы, мы оптимизировали трансфекции и нокдаун методы 12-16 в двух клеточных линий мыши макрофагов, RAW264.7 17 и J774A.1 18. Этот подход использует Amaxa Nucleofector Shuttle System 96-а для трансфекции; эта системаиспользует комбинацию специализированных реагентов и электропорации для трансфекции клеток в формате 96-луночного 19. После трансфекции мы опишем методы, чтобы максимизировать восстановление и жизнеспособность клеток и для максимального последующее миРНК вызванной генной нокдаун. Чтобы проиллюстрировать полезность этого подхода, мы опишем протокол для миРНК доставки этих макрофагов клеточных линий, стимулируют эти клетки с липополисахарида (ЛПС), и следить за врожденный иммунный ответ на уровне производства нескольких провоспалительных цитокинов. Мы предоставляем образцы данных, в которой мы нацелены на Toll-подобный рецептор (TLR) семья, члены которой чувствуют LPS и другие патогенные ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs), регулировать врожденный иммунитет.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Поддержание макрофагов клеточных линий

  1. Выращивают RAW264.7 и J774A.1 клеточные линии в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в присутствии 5% СО 2. Для поддержания стерильности, добавить 1% пенициллина / стрептомицина (ручка / острый) в средствах массовой информации (хотя это не является строго необходимым).
  2. Критический шаг: Убедитесь, что для эффективной трансфекции и миРНК-индуцированного гена нокдаун макрофаги растут в здоровом состоянии. Используйте ячейки между проходами 3 и 10 после свежего оттаивания, так как эти макрофаги линии демонстрируют лучшую эффективность трансфекции и поддерживать надежную выживание после трансфекции на данном этапе; не используйте более высокую проход количество (> 20), а эффективность трансфекции и гена нокдаун и уменьшаться значительно.
  3. Для оптимизации миРНК трансфекции, пластинчатые клетки на 20% слияния и расти один или два дня, пока клетки не достигают не более 80% слияния. Заросли клетки не будут трансфекции efficровать.

2. Программирование Shuttle System 96-а для трансфекции

  1. Запустите программу трансфер 96-а на компьютере, подключенном к челноку. Выберите новый файл параметров в верхнем меню левой файла.
  2. Выделить скважин, которые будут трансфицированные на отображаемом пластины схеме 96-луночного. Зеленый ящик будет указать, какие скважины выбираются.
  3. Выберите программу, соответствующую клеточную линию макрофагов используется (DS-136 для RAW264.7 или DS-130 для J774A.1) и выберите Применить, расположенной ниже схематически 96-луночного планшета. Обратите внимание, что после выбора программы, колодцы на схематическом пластины будут окрашены темно-синий. Пустые кружки скважин, которые не были назначены программу и не будут шокированы.

3. Подготовка реагентов для трансфекции

  1. Подготовка рабочего раствора Nucleofector ™ путем смешивания SF клеточной линии 96-а решение Nucleofector ™со всем содержимым закрытом дополнения трубки. Разрешить смешанные реагенты для уравновешивания при комнатной температуре перед использованием. Хранить лишний полное решение Nucleofector ™ на 4 ° С на срок до 3 месяцев для использования в будущем.
  2. Предварительно теплой DMEM, RPMI-1640, 0,25% трипсин / ЭДТА, и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при 37 ° С до получения макрофаги для трансфекции.
  3. Подготовьте миРНК для трансфекции оттаивания на льду. Для того чтобы минимизировать количество замораживания оттепели в миРНК, заморозить новых миРНК в виде аликвот в первый раз, когда они используются.
  4. В начальных экспериментах, использовать миРНК при относительно высокой дозе 2 мкМ (разбавленных 1:10 от 20 мкМ запасов). Впоследствии титруют киРНК, которые вызывают устойчивый ген нокдаун до более низких дозах, хотя, как правило, более высокие дозы необходимы для эффективного гена нокдауна в макрофагах по сравнению с другими типами клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: миРНК доступны из многих источников; довольно прочная ген нокдаун можно получитьиспользуя siGenome SMARTPOOLs, которые бассейны четырех миРНК, ориентированных каждый ген. В качестве отрицательного контроля, использовать любой из различных ненацеливании бассейнов миРНК или миРНК.
  5. Чтобы контролировать эффективность трансфекции, трансфекции либо контрольную плазмиду pmaxGFP (представленную в наборах Amaxa) или флуоресцентно меченные киРНК параллельно экспериментальным киРНК. Ожидайте 30-50% трансфекции в GFP плазмиды (анализировали с помощью микроскопии или проточной цитометрии дня после трансфекции) и> 99% трансфекции флуоресцентно меченных миРНК (анализировали с помощью проточной цитометрии сразу после трансфекции и восстановления).

4. Подготовка макрофагах для трансфекции

  1. Снять прилипшие макрофаги из чашки для культивирования клеток трипсинизацией. Аспирируйте СМИ и промыть клетки дважды 10 мл PBS. После удаления PBS, инкубировать клетки с предварительно нагревают 0,25% трипсин / ЭДТА (1 мл / 10 см пластина) в течение 1-2 мин, пока клетки начинают отделяться. Аккуратно постучите по планшету и переместить Солуции во время инкубации, чтобы максимизировать трипсинизации.
  2. После инкубации добавляют 9 мл DMEM + FBS СМИ, аккуратно перемешать вверх и вниз, и сбора клеток с помощью пипетки в стерильную пробирку.
  3. Подсчитайте количество выделенных макрофагах использованием гемоцитометра. Ожидать около 10 млн макрофаги на 10 см тарелку. Рассчитать общее количество макрофагов, необходимых; каждую лунку на трансфер 96-а требуется 200 000 клеток. Не забудьте добавить ценность несколько дополнительных скважин клеток для обеспечения потерь пипеток.
  4. Внесите расчетное число клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга клетки в течение 10 мин при 150 х г при комнатной температуре. Не центрифугировать слишком быстро, как это будет уменьшаться макрофагов здоровье и эффективность трансфекции.

5. Nucleofection макрофагов с миРНК

  1. Используя стерильный 96-а вокруг нижнюю пластину (что облегчает смешивания при минимизации потери реагента), добавить 2 мкл каждого миРНК в каждую лунку, чтобы быть Transfected.
    Примечание: В зависимости от количества миРНК, это может быть достигнуто в ходе стадии центрифугирования макрофагов.
  2. Аспирируйте носитель из центрифугированных клеток. Аккуратно ресуспендирования клеток в растворе Nucleofector ™ SF (содержащие добавки решение), с использованием 20 мкл на 200 000 клеток гранулированных. После ресуспендировали, использовать клетки сразу для оптимальной трансфекции.
  3. Трансфер ресуспендировали клетки в стерильный корыта; с помощью многоканальной пипетки, передача 20 мкл ресуспендированных смеси клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего киРНК. Аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Передача 20 мкл клеток / миРНК смеси в 96-луночный планшет Nucleocuvette ™ важным шагом:. Избежать образования пузырьков в процессе стадии передачи, поскольку это может вызвать ошибки при Nucleofection.
  5. После размещения всех экспериментальных образцов в трансфекции пластины, покрывают 96-луночный планшет с крышкой и предоставленной Verу слегка постучите по твердой поверхности, чтобы удалить пузырьки из образцов.
  6. Поместите 96-луночного планшета с крышкой в ​​96-луночного трансфер Nucleofector и выберите "загрузить и запустить" в правом нижнем углу экрана программы. До Nucleofection, следовать строки программы, чтобы сохранить результаты.
    Примечание: Во время процесса Nucleofection, колодцы успешно tranfected будет изображен на 96-и принципиальная на экране зеленым кругом со знаком плюс. Красный круг с минусами указывает на ошибку, скорее всего, из-за пузырьков или неправильно пипетки правильный объем реагентов.

6. Восстановление и покрытие из макрофагов

  1. Сразу же после Nucleofection, используя многоканальную пипетку, добавьте 80 мкл подогретого (37 ° С) RMP1-1640 носитель в каждую лунку. Добавить СМИ в сторону друг хорошо, позволяя СМИ медленно перемешать с трансфекции клеток, которые очень нежный на данном этапе. Не добавляйте носитель слишком быстро, так как это будетзначительно уменьшить жизнеспособность.
  2. Поместите 96-луночных планшетах с трансфицированных образцов и RPMI-1640 в инкубаторе 37 ºC с 5% CO 2 в течение 2 мин; это имеет решающее значение, чтобы позволить клетки, чтобы восстановить до дальнейшей обработки.
  3. Извлеките 96-луночного планшета из инкубатора и тщательно переноса смеси из каждой лунки в культуре ткани 96-луночного планшета с использованием многоканальной пипетки.
  4. Используя многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл подогретого (37 ° С) DMEM + FBS среды в каждую лунку.
  5. Инкубируйте тканевой культуре 96-луночного планшета с образцами в инкубаторе 37 ºC с 5% CO 2 в течение 24-36 ч (оптимизации точную синхронизацию для отдельных киРНК, но на этот раз диапазон, как правило хорошо работает).

7. Стимулирование макрофагов с ЛПС

  1. После 24-36 ч после Nucleofection инкубации подготовить LPS (или другой PAMPs) в свежем СМИ. Подготовьте достаточно свежую среду для всех скважин (200 мкл мEdia / лунку 96-луночного планшета плюс немного за пипетки). Развести LPS в конечной концентрации 20 нг / мл в DMEM + FBS.
  2. Тщательно аспирата средств массовой информации из 96-луночного планшета и добавить свежий СМИ содержащий LPS в клетках.
  3. Следить за ответ на ЛПС или других PAMPs в разное время после стимуляции. 6 ч является достаточным, чтобы генерировать надежную воспалительную реакцию цитокинов для цитокинов, таких как IL-6 или ФНО.

8. Контроль за индуцированные врожденного иммунного ответа, Нокдаун гена, и жизнеспособность в макрофагах

  1. Для контроля ЛПС-индуцированную продукцию цитокинов, пипетки супернатант от клеток в тарелку хранения 96-луночного. Продукция цитокинов может быть измерена с помощью ELISA.
  2. После того, как удаляют надосадочную жидкость, контролировать жизнеспособность клеток с использованием флуоресцеина диацетат (при расщеплении с помощью клеточных эстераз в живых клетках, это соединение становится флуоресцентный). Определить миРНК, которые предназначаются гены, которые управляют жизнеспособности клеток с помощью тего подход. Примечание: сам процесс трансфекции должны иметь небольшой эффект на жизнеспособность, если правильно выполнены.
    1. Добавить флуоресцеина диацетат (5 мг / мл в ацетоне акций) в каждую лунку (1: 100 конечном разведении в PBS).
    2. Инкубируют при комнатной температуре в течение 4:59 мин, а затем контролировать флуоресценции в клетках с использованием планшет-ридера (460 нм возбуждение, 515 нм эмиссии).
    3. Дополнительно: Для того, чтобы флуоресценции в лунках однородна, лизируют клетки, использующие буферы, такие как RIPA; это обеспечивает равномерное флуоресцентного сигнала в скважине, так как некоторые читатели пластины выполнен с возможностью отслеживать только небольшую часть скважины; если клетки не равномерно покрытием, флуоресцеин диацетат может дать неточное чтение.
  3. В качестве альтернативы мониторинга жизнеспособности клеток, контролировать ген миРНК-индуцированной нокдаун путем количественной ПЦР с использованием РНК, полученной из адгезивных клеток.
    1. После супернатант удаляют из клеток (шаг 8,1 выше), объявлениеd RLT буфера (который используется для лизиса и сохранения РНК) непосредственно в адгезивных клеток лизировать их.
    2. Изолировать РНК с использованием препарата комплект РНК, таких как мини-комплект RNeasy, и использовать КПЦР с геноспецифических праймеров для контроля Нокдаун гена относительно контроля лечения миРНК. Используйте праймеров к Βactin или GAPDH для нормализации.
  4. В качестве другой альтернативы, чтобы контролировать другие аспекты врожденной иммунной реакции, контролировать фагоцитарную способность макрофагов путем добавления FITC-меченого E. палочки частицы непосредственно на прикрепленных клеток с использованием набора. После протокол производителя, который занимает всего несколько часов, контролировать фагоцитарную поглощение с помощью планшет-ридера или микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность трансфекции с использованием этого подхода, мы контролировали поглощение FITC-меченого миРНК используя цитометр потока (рисунок 1).

Чтобы проиллюстрировать полезность нашего подхода к мониторингу врожденный иммунный отв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Многочисленные исследования были опубликованы в которой отдельные гены были мишенью миРНК в макрофагах мышей. В то время как липидный опосредованной трансфекции был использован для доставки миРНК для макрофагов клеточных линий на индивидуальной основе, эти методы страдают от потенц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы. Эта статья была организована Lonza, Inc.

Благодарности

Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle systemLonzaAAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kitLonzaV4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell lineATCCTIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell lineATCCTIB-67
siGenome smartpool siRNADharmaconvaries depending on gene
Non-targeting control siRNA poolDharmaconD-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporationInvitrogen13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPSList Biological Laboratories421
DMEM, high glucoseInvitrogen11995-065
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)FisherSV30010
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200072
96-well tissue culture platesFisher07-200-89  
96-well round bottom sterile plates (not coated)Fisher07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kitR&D BiosystemsDY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kitR&D BiosystemsDY410
Fluorescein diacetateSigma-AldrichF7378
RLT bufferQiagen79216
RNeasy mini kitQiagen74134
Vybrant Phagocytosis Assay KitInvitrogenV-6694

Ссылки

  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
  4. Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
  5. Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
  6. Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
  7. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
  8. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
  9. Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
  10. Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
  12. Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
  13. De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
  14. Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
  15. Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
  16. Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
  17. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  18. Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
  19. Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
  20. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  21. Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
  22. Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732(2001).
  23. Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
  24. Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

93RAW264 7J774A 1LPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены