Nanopodia - Тонкие, хрупкие Мембранные Прогнозы с ролями в сотовых передвижении и межклеточных взаимодействий

Резюме

Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.

Аннотация

Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 ​​до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.

Введение

Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками ^1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток ^2,3.

TM4SF1 представляет собой белок с tetraspanin, как топологии, который был первоначально известен как антигеном опухолевых клеток ⁴ до открытия, что молекула эндотелиальных биомаркеров клеток, что играет существенную роль в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции ^2,3. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что TM4SF1 локализуется в perinucLear пузырьки и в плазматическую мембрану, и обогащен ТМ 4SF1 электронных nriched микро г omains (Tmed). Tmed якорь nanopodia к матрице и присутствует в регулярно расположенные Banded рисунком 1-3 длины Tmed / мкм из nanopodia. Nanopodia обычно простираются от переднего фронта клетки и конце задней течение поляризации клеток для движения. В связи с твердым приверженцем природы Tmed, nanopodia не в состоянии отказаться обратно в камеру, как она движется в сторону; брошенные остатки nanopodia таким образом проследить путь сотовой движения. Nanopodia обеспечить мембранные каналы для F-актина выдвижения и втягивания, и являются местами межклеточных взаимодействий и коммуникаций ^2,3. Эти характеристики означают, что nanopodia предоставляют уникальную возможность для изучения механизмов, лежащих F-сборку актина во время клеточного поляризации, клеточном зондирования окружающей среды, определения пути и направления движения клеток и межклеточных взаимодействийй коммуникации.

В связи с высокой гидрофобной природы Tmed и тонкой и хрупкой мембранного природы nanopodia, особое внимание должно быть принято в целях сохранения Tmed и nanopodia. Разрушение nanopodia и удаления Tmed по распространенных методов лабораторных является возможная причина, почему только шестьдесят три публикации появились на TM4SF1 с момента своего первого открытия в 1986 ¹ и для полного незнания TM4SF1 обогащения в 100-300 мкм микродоменов на клеточной поверхности до доклада TM4SF1 в эндотелиальных клетках в 2009 году ^2.

Обычные методы иммунным окрашиванием обычно используют органические растворители, как этанол, метанола, ацетона или исправить клетки и используют 0,1% или более высокую концентрацию Triton X-100 в проницаемыми клеткам ^5. Исследования, описанные здесь реализуется три основных изменения с обычным способом выявить Tmed и nanopodia: (я) использовать 37 ° C 4% PFA и исправить клеток в 3776; C инкубатор, (II) нежный комнатной температуры стирки PBS, и (III) используют менее 0,03% Triton X-100 только кратко проницаемыми клетки перед добавлением первичного антитела, как Triton X-100 выше, чем 0,03% извлечет TM4SF1.

Все tetraspanins образуют микродомены на клеточной мембране ⁶ и некоторые локализуются с Tmed в эндотелиальных и опухолевых клеток ^2,3. Как tetraspanins как CD9, CD81, CD151 и экспрессируются повсеместно, протокол окрашивания описанный здесь, может быть продлен до многих различных типов клеток, которые не имеют TM4SF1 для исследований функции nanopodia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура клеток на коллаген стекла с покрытием диска

1. Место стеклянные диски (12 мм в диаметре) в стеклянной банке (4 унции) и автоклав для стерилизации диски.
2. Положите 25 мл 70% этанола в 50 мл трубки Сокол и поместить его в капот культуре клеток. Это решение может быть повторно использован многократно, пока уровень раствора не падает до 20 мл.
3. Поместите острые щипцы с дополнительной тонкой точке в 70% этанола в течение 5 мин перед использованием его для обработки стекла диск.
4. Осторожно снимите щипцы из трубки и закройте крышку, затем аккуратно поместите этанола обрабатывают щипцами на верхней части трубки высохнуть на воздухе в течение 2 мин. Не допускайте, чтобы кончик пинцетом касаться чего-либо в капюшоне.
5. Используйте стерильного пинцета, чтобы захватить один стерильный стеклянный диск из стеклянной банке и поместить его в лунку для культивирования клеток пластины 24-а. Повторяйте, пока желаемое количество скважин не была заселена с дисками.
6. Поместите 500 мкл раствора бычьего коллагена (50 нг / мл) в каждую лунку, которая содержит стеклянную диск и поместить его в 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора клеток культуры, по крайней мере 30 мин. Там нет никакого вреда в долгосрочной инкубации.
7. Урожай HUVEC (Human эндотелиальных клеток пупочной вены) или PC3 предстательной железы (опухолевые клетки), которые уже были выращены в 150 мм клеточной культуральной пластины с помощью обработки трипсином и блокируют активность трипсина, используя его полной культуральной среде. Сбор клеток в 15 мл сокола трубки.
8. Подсчитайте количество клеток и убедитесь, что жизнеспособность более 90%.
9. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
10. Используйте культуральной среды для разбавления клеток до 10 ⁵ клеток / мл. Поместите клетки на льду.
11. Аспирируйте коллагена в капот культуре клеток и осторожно поместить 500 мкл суспензии клеток в каждой лунке, в которой стекло диски были предварительно покрытый коллагеном. 5 х 10 ⁴ клеток / лунку в 24-луночный планшет даст 60% конфluency для HUVEC и 30% слияния для клетках РС3. Примечание: добавить больше клеточной суспензии для более высокой плотности клеток.
12. Культуры клеток в 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора в течение 1 часа, 2 часа, 4 часа, 6 часов, или 24 часов, чтобы отслеживать nanopodia деятельности и переход клеток. Как правило, клетки будут приложить к стеклянный диск в первые 30 мин, после чего можно будет поляризовать и мигрируют в течение первого часа, а также выполнять межклеточные взаимодействия и деление клеток в следующих часов.

2. Сотовый Фиксация

1. Каждый хорошо понадобится 500 мкл 4% PFA (параформальдегида) для фиксации клеток. Либо коммерчески изготовлены или свежеприготовленные 4% PFA может быть использован. Рассчитать количество PFA, необходимое на основе количества скважин, приготовленных, и поместить PFA в 15 мл трубки сокола. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде потенциальный канцероген.
2. Положите трубки сокола в пенополистирола стенде, который был уже на месте в 37 ° C инкубаторе. Оставьте трубку в инкубаторе в течение 30 мин до войным до свободной зоны до 37 ° С.
3. Поместите грелку в капот культуры и включите его.
4. Выньте клеточной культуры пластину 24-а и нагретого PFA из инкубатора и разместить его на верхней части грелку.
5. Одной рукой аспирации среды из скважины, и сразу же после использования другой рукой аккуратно сдвиньте 500 мкл PFA в колодец через а края. Для облегчения аспирации, наклонить культуральный планшет при температуре около 45 °, опираясь его против пенополистирола стенде так, что она стабильна под этим углом. Это будет способствовать стремление и добавления PFA решение колодца, не нарушая клетки в культуре. Это самый важный шаг, чтобы сохранить оригинальный клеточную структуру клеточных деятельности.
6. Повторите процесс, пока все скважины с стеклянный диск не получили PFA. Примечание: все шаги, которые необходимо изменить уже существующие решения от колодца будет применять те же процедуры аспирации.
7. Место пластины в 37 ° С в течение 5 мин.
8. Возьмите тарелку обратно в капот культуры и наклона против пенополистирола как описано в шаге 2.5. Одной рукой осторожно перенести PFA из колодца в пробирку; использовать другую руку, чтобы сразу же после этого разместить по крайней мере, 500 мкл температуры в помещении PBS в скважине. После того как все колодцы были вымыты, вернуться и повторить промывку PBS еще раз в каждую лунку. Слейте собранную PFA в контейнер с опасными отходами.
9. Подготовка блокирующий буфер ICC добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки в PBS. 0,04% азид натрия (разбавленный 20% от исходного раствора) добавляют в качестве консерванта. ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным соединением. Буфер может быть сохранен в 4 ° С в течение длительного периода времени без бактериального заражения.
10. С планшета для культуры еще наклоненной против подставке, еще раз перебирать каждую лунку аспирационных удалить PBS и сразу же после этого, добавив 500 мкл ICC блокировки буфера. Клетки готовы к иммунофлуоресцентного окрашивания. При необходимостификсированные клетки могут быть сохранены в 4 ° С холодильником в течение недели без значительной потери TM4SF1 белка.

3. TM4SF1 Иммунофлуоресценции Окрашивание Nanopodia

1. В каждой лунке заменить 500 мкл ICC блокирующий буфер с новым блокирующем буфере, содержащем 0,01% Triton X-100 и оставьте при комнатной температуре в течение 1 часа. Не следует использовать выше, чем 0,03% Triton X-100, как это будет удалить TM4SF1 из клеточных мембран. PBS клетки промывали с шагом 2,10 может быть непосредственно перемещается в блокирующем буфере, содержащем Triton если окрашивание готов быть начата немедленно.
2. Развести первичного анти-TM4SF1 (или анти-CD9) антитела с 0,5 мкг / мл в блокирующем буфере ICC.
3. В каждую лунку, удалите ICC/0.01% Triton буфер и заменить его 300 мкл анти-TM4SF1-антител решения. Инкубировать 2 часа при комнатной температуре или оставить на ночь при 4 ° С.
4. Вымойте каждую лунку с не менее 500 мкл PBS. Повторите 3 раза; каждый раз дают в леаст 5 мин времени инкубации.
5. Подготовка вторичного антитела и фаллоидином решение в ICC блокирующем буфере, используя 1000 раз разведение в Alexa 488 помечены осел против мышиного вторичных антител (2 мкг / мл конечной концентрации) и 1000 х разбавление фаллоидином (50 нг / мл конечная концентрация).
6. Удалить PBS и добавьте 300 мкл вторичного антитела и фаллоидином раствора в каждую лунку и инкубировать в течение 2 часов или оставить его на ночь при 4 ° C.
7. Повторите промывание PBS с по крайней мере 5 мин инкубации в стирке. В последней промывки оставить каждую лунку PBS в течение 1 часа.
8. Оставьте ни капли (~ 10 мкл) анти-выцветанию монтажа СМИ на предметное стекло.
9. Согните кончик 19 G 1 ½ в иглу шприца 90 °, нажав аккуратно на твердую поверхность. Одной рукой удерживайте согнутых иглу и осторожно поднимите стеклянную диск из колодца, и использовать другую руку, чтобы схватить диск с помощью острых щипцов.
10. Поверните стеклянный диск &# 160; лицом вниз позволяя боковую клеток контакт монтажа медиа на предметное стекло. Аккуратно поместите стеклянную диск и дайте ему высохнуть в течение ночи в темном месте при комнатной температуре.
11. Перейдите к изображению иммунофлюоресценции окрашенных nanopodia или хранить слайды в режиме слайд-поле при температуре -20 ° С. Слайды останется просмотра в течение нескольких месяцев в -20 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для Шаг 1:

Если клетки (например, HUVEC и PC3 используемые в данном исследовании) способны нормально расти, клетки будут приложить к коллагена покрытием диска в течение 30 мин после того как они высевают, поляризовать и становятся подвижными вскоре, и расширить nanopodia впереди сво?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия ^2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки ос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer