Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Резюме

Лейкоцитов вербовки в печень происходит в рамках специализированных каналов печеночных синусоидов, которые выстроились по уникальным печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток. Фаза контраст микроскопия набора лейкоцитов через человека печеночной синусоидальной эндотелия в условиях физиологического напряжения сдвига может способствовать выяснению молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.

Аннотация

Лейкоцитов проникновение в ткани человека печени является общим процессом во всех взрослых воспалительных заболеваниях печени. Хронический инфильтрация может стимулировать развитие фиброза и прогрессирования цирроза. Понимание молекулярных механизмов, которые опосредуют вербовки лейкоцитов в печень может определить важные терапевтические цели для заболевания печени. Ключ взаимодействие при приеме на работу лейкоцитов, что воспалительных клеток с эндотелием в условиях напряжения сдвига. Набор для печени происходит в течение низкого сдвига каналов печеночных синусоидов, которые выстроились в печени синусоидальных эндотелиальных клеток (HSEC). Условия в печеночных синусоидов можно воспроизводятся путем перфузии лейкоцитов через каналы выстроились человеческими монослоев HSEC в определенных расходах. В этих условиях подвергаются лейкоциты краткое шаг модема с последующей активацией и твердой адгезии, а затем обхода этапе и последующей трансмиграции через эндотелиальныеслой. Использование фаз контрастной микроскопии, каждый шаг этого «адгезии каскада" могут быть визуализированы и записал с последующим автономного анализа. Эндотелиальные клетки или лейкоциты могут быть предварительно обработаны ингибиторами определить роль специфических молекул в этом процессе.

Введение

В настоящее время хорошо известно, что вербовка лейкоцитов в целом следует парадигму многоступенчатой ​​адгезии каскада ^1. Это включает в себя захват лейкоцитов из крови, протекающий по эндотелиальных клеток, выстилающих стенки сосуда. Первоначально, лейкоциты проходят прокатки шаг, который опосредуется селектину рецепторы или членов надсемейства иммуноглобулинов. Это позволяет G-белками рецепторы (GPCR) экспрессируется на поверхности лейкоцитов быть активирован хемокинов, представленных на эндотелиальной гликокаликса. Это приводит к изменению подтверждения интегринового к "высоким сродством» состоянии на поверхности лейкоцитов и арестовать и фирма адгезии к эндотелию. Фирма адгезия затем следуют изменения формы и сканированию в лейкоцитов на судне. Последним шагом является переселение через эндотелия монослоя, которая может осуществляться посредством парацеллюлярная или трансцеллюлярного маршрутов.

В то время как многоступенчатая адгезия каскад описатьс общий механизм вербовки лейкоцитов в организме есть орган специфические отличия. В печени большинство найма лейкоцитов происходит в течение печеночных синусоидов, в отличие от других органов, где набор обычно происходит в течение посткапиллярных венул ^2. Печеночные синусоиды являются экологически низкой скорости сдвига и лейкоциты пройти краткий шаг модема предварительное фирме адгезию который селектином независимую ^2. Эти каналы выстланы печеночной синусоидальной эндотелия, который является прерывистой и содержит fenestrae, открытые поры 100-200 нм в диаметре, и не имеют базальную мембрану ^3. Выяснение молекулярных механизмов, которые опосредуют вербовки лейкоцитов через человека печеночной синусоидальной эндотелия может определить орган конкретные терапевтические цели для воспалительных заболеваниях печени.

Адгезии потока анализы являются важными инструментами в изучении набора лейкоцитов. Они позволяют реконструкция лейкоцитов recruitment в присутствии напряжения сдвига для анализа адгезии при четко определенных сил. Наиболее частое применение для анализа является изучение адгезии лейкоцитов к культивируемых эндотелиальных монослоев, либо из очищенных поверхностей. Коммерчески доступные камеры потока используются для заливать клетки в условиях ламинарного потока между двумя плоскими поверхностями, а затем визуализировать динамический процесс адгезии на микроскопе ^4. Предыдущие группы продемонстрировали, что некоторые клейкие взаимодействия происходить только в потоке и не могут быть изучены в статических анализов ^5,6.

Мы использовали эту технику, чтобы резюмировать печеночные синусоиды и изучить набор лейкоцитов в условиях низкой напряжения сдвига. Первичный человеческий HSEC культивируют в microslides и лейкоцитов может быть перфузии в течение этого монослоя со скоростью потока, вычисленного для воспроизведения напряжение сдвига в печеночных синусоидов. Напряжение сдвига является стресс, который применяется параллельно или по касательной к поверхности, как оппosed для нормального напряжения, которая перпендикулярна. Любая жидкость, которая движется вдоль границы окажет напряжения сдвига на этой границы. Напряжение сдвига было показано, чтобы быть важным компонентом лимфоцитов переселении ^7. В этих условиях каждый шаг адгезии каскада могут быть визуализированы с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот метод позволил сделать важные выводы в вербовке лейкоцитов в печени в том числе при изучении обычных молекул адгезии ^8, роли хемокинов и рецепторов хемокинов ^9-11 и атипичных молекул адгезии, таких как сосудистые адгезии белка-1 (VAP-1 ) ^8,12 и здравый лимфатической и эндотелия сосудов рецептора-1 (CLEVER-1) ^13. Хотя это исследование было упомянуто в нескольких публикациях нашей группы, ее описание было кратким и мы воспользовались этой возможностью, чтобы представить подробный пошаговое руководство, чтобы помочь в устранении неполадок и предотвращения возникновения технических ошибок при попыткеING анализа. Кроме того, мы недавно изменили размещения заказов на предметное стекло камеры, которая позволяет точные изменения в напряжения сдвига. Мы считаем, что это расширяет применимость анализа с другими эндотелиальных и иммунных клеток. Следующий метод описывает получение и методика проведения потока на основе анализа адгезии с человеческими печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток и лимфоцитов периферической крови.

протокол

1. Предметное стекло Подготовка

1. Намывная шесть канал предметное стекло с хвоста крысы коллагена типа I (РТК, разводили в PBS 1:100 дает готового раствора 220 мкг / мл). Это выполняется путем инъекции 30 мкл разбавленного раствора РТК непосредственно в каналы и инкубации в течение 2 ч при 37 ° С, с последующим трех промывок ЗФР.

2. Посев Клетки в Microslides

1. Диссоциируют сливающийся T75 колбу культивированных человеческих печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток (HSEC) (изолированные от ткани печени, как описано выше ¹³⁾ в трипсина-EDTA, умойся в PBS, и ресуспендируют в 3 х 10 ⁶ клеток / мл в полной среде (человеческий эндотелия базальные носители с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и стрептомицина 100μg/ml, 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека AB, 10 нг / мл фактора роста эндотелия сосудов и 10 нг / мл фактора роста гепатоцитов). Введите 30 мкл клеточной суспензии страшныеctly в каждом канале.
2. Оставьте клетки придерживаться в течение 1 часа во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO ₂ атмосферы на слайд стойку. После позволяя клеткам придерживаться заполнить порты по обе стороны от каждого канала с полной среде (рис. 1).

3. Цитокинов стимуляции клеток

1. Оставьте клетки в инкубаторе в течение 24 часов. Оценка роста клеток с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа. 24 ч до анализа адгезии, стимулируют эндотелиальные монослои с цитокина путем замены ростовой среде с полной среды дополненных фактор некроза опухоли альфа и интерферона-гамма, как на 10 нг / мл.

4. Выделение лимфоцитов периферической крови

1. Изолировать лимфоцитов периферической крови из цельной крови путем первоначального очищения мононуклеарной фракции по центрифугирования в градиенте плотности над соответствующим центрифугирования СМИ разделения клеток в течение 25 мин при 800х г. Инкубируйте клетки на пластиковых течение 1 часа, чтобы позволить приверженность моноцитов.
2. После присоединения к пластиковой аспирации лимфоцитов обогащена супернатант. Промыть лимфоциты и ресуспендируют их (обычно 1 х 10 ⁶ клеток / мл в среде потока (эндотелиальные базальные среды, содержащие 0,1% (объем / объем) бычьим сывороточным альбумином (BSA)).

5. Предварительная обработка эндотелия или Лейкоциты с ингибиторами

1. Подготовка рекомендуемых разведений функции блокирования антител или низкомолекулярные ингибиторы в эндотелиальных media/0.1% (объем / объем) БСА. Заменить полной среде с блокировкой антитела / ингибитор решение в выбранной предметное стекло канала за 30 мин до течь анализа.
2. Где предварительной обработки рецепторов хемокинов на лимфоцитах запланированы, ресуспендируют изолированных лейкоцитов в растворе RPMI, содержащей 0,1% (объем / объем) BSA и инкубируют с 200 нг / мл коклюшного токсина, чтобы блокировать G-белком рецептор активность рецепторов хемокинов; альтернативно разбавить конкретных функцияблокирующие антитела или низкомолекулярные ингибиторы рецепторов хемокинов при рекомендованной разбавления. Выдержите лейкоциты при 37 ° С в течение 30 мин, затем промыть и ресуспендируйте в текучей среде.

6. Настройка расхода пробирной системе

1. Prewarm термостатом прозрачную камеру до 37 ° C. Камера должна иметь порты для вставки силиконовые трубки и электронной питания для электронного электромагнитным клапаном, который позволяет переключаться между клетками и СМИ практически без мертвого объема. Камера установлена ​​на инвертированный микроскоп, чтобы позволить фазового контраста микроскопии. 2 демонстрирует поток анализа камеры и предметное стекло микроскопа и помещают на столик микроскопа.
2. Prefill стеклянный шприц 50 мл с замком Люэра с 10 мл стерильной дистиллированной воды и прикрепить длину 25 см силиконовой трубки в шприц порт. Вставка в шприцевой насос. Измените скорость вывода шприцевой насос в соответствии синструкциями предметное стекло производителя поддерживать напряжение сдвига 0,05 Па (0,5 дин / см ^2, рисунок 3).
3. Возьмите два 5 мл шприцы, отказаться от поршни и прикрепите баррелей до двух в-поток портах электронной электромагнитного клапана с использованием силиконовых трубок.
   1. Прикрепите 12 см силиконовой трубки к клапану вне потока. Клапан обеспечивает чередование между свободным буфером для промывки ячеек (эндотелиальный media/0.1% (объем / объем) BSA) и суспензии лимфоцитов.
   2. Флеш электронный электромагнитный клапан, вставив промывочного буферного раствора в обоих шприцов и обеспечение буфер течет от одного ствола через клапан и в силиконовой трубки из потока.
   3. С помощью переключателя клапана чередовать с другим стволом и обеспечить буфер течет и что все пузырьки удаляются из системы. Удалить мыть буфер из одной из бочек и заменить лимфоцитов подвеска рисунке 4a.
4. Подключите силиконовый Тубинг из шприцевой насос к одному порту выбранной предметное стекло канала через адаптер предметное стекло. Затем подключите силиконовых трубок от оттока клапана на противоположную порту через адаптер предметное стекло. Убедитесь, что трубка силикон и адаптеры заполнены промывочного буфера до связи, чтобы предотвратить воздушные пузырьки входа в систему (рис. 4б).
5. После присоединения к системе потока, поместите предметное стекло на столике микроскопа и прикрепить скобами или ленты, чтобы предотвратить движение. Установите микроскоп к цели 10X вместе с соответствующим установки фазы. Убедитесь, что эндотелия монослой визуализируется и в фокусе помощью глазной линзы. Обеспечить изображения могут быть захвачены с помощью камеры, который прикреплен к микроскопу в результате чего изображения могут быть переданы на монитор и записывается.

7. Расход Пробирной Техника и запись сцепления для анализа

1. Заливать эндотелия слой с промывочного буфера в течение 2 мин, начав withdrawaл шприцевой насос, чтобы удалить весь мусор или несвязанного блокирующий антитела, а затем переключить клапан, чтобы позволить 5 мин болюс лейкоцитов растворе при постоянном напряжении сдвига стены 0,05 Па
2. В течение последних 2 мин от лейкоцитов болюса, запись 10 случайных полей вдоль длины предметное стекло. Это позволяет автономному анализу лимфоцитов прокатки / модема на эндотелиальной монослоя. Запишите каждое поле в течение примерно 10 сек до переезда в следующий и убедитесь, что запись производится против направления потока, чтобы избежать записи тот же качению ячейку два раза в быстрой последовательности.
3. Выполните лейкоцитов болюс с 5 мин болюса промывочного буфера путем возврата клапана в исходное положение. На заключительном 2 мин этого болюса проводить вторую фазу записи путем выбора по меньшей мере 10 случайно выбранных полей по длине на предметное стекло. Запишите каждое поле в течение примерно 5 сек, прежде чем перейти к следующему, и гарантировать, что эндотелия монослой и приверженцем leucocytes находятся в четкой направленности. Это позволяет автономному анализу рисунка адгезии.

Результаты

Этот анализ имеет возможность визуализировать многоступенчатый адгезии поток каскад и выяснить основные молекулярные механизмы, сравнивая результаты контрольных опытов с теми, с молекулярными ингибиторов. Различные сосудистые кровати могут быть воспроизводятся путем включения конкретных эндотелиальные клетки и изменения сдвига стрессовые состояния.

Каждый шаг адгезии каскада могут быть проанализированы форума, следуя способа записи, изложенной в протоколе. Первый этап адгезии каскада прокатки лейкоцитов, которые могут быть выражены в виде процента от общего количества прикрепленных клеток. Офлайн анализ позволяет количество прикрепленных клеток, которые будут перечислены в каждой записанной области в течение лейкоцитов болюса. Воспроизведение изображения позволяет сравнивать клеток, которые твердо приверженцем и те, которые переживает качение через эндотелий. Роллинг движения могут быть визуализированы с помощью этой техники, каждое поле записывается по крайней мере 10 секунд. Прокатные клетки идентифицируются по их уменьшенной скоростью по поверхности эндотелиальных по сравнению с текущей клетки. Такое поведение должно быть продемонстрировано, по крайней мере 5 секунд без отрыва. Адгезия каскад в печеночных синусоидов происходит в среде с низким усилием сдвига и в естественных условиях исследования подтвердили минимальный прокатки только с кратким шагом привязывать. Мы подтвердили, что анализ потока отражает среду печеночных синусоидов, демонстрируя, что менее 10% от прилипших лейкоцитов упорно перевернуться вынужденного HSEC в этих анализах.

Следующим шагом адгезии каскада фирма адгезии. Всего соблюдение может быть рассчитана из второй стадии записи во время мытья буферной болюса (шаг 7.3). Офлайн анализ позволяет общее количество твердо прикрепленных клеток, которые будут учитываться в каждом поле (рис. 5). Твердо прилипшие клетки определяются как клетки, которые являются стационарными или shapechanged с медленным поведения ползания.Среднее число клеток на поле, то можно рассчитать. Этот показатель может быть использован в сочетании с общей площадью поверхности в поле зрения (определяется с помощью координатной сетки или эквивалент), концентрацию лимфоцитов (обычно 1 х 10 ⁶ клеток / мл) и скорость потока, чтобы выразить степень лимфоцитов соблюдение как прилипшие клеток / мм ^{2/10 6} клеток перфузии.

Изучая структуру адгезии включает анализ последних двух шагах от адгезия каскад в том числе формы-изменения, ползать и трансэндотелиальный миграции. Лейкоциты прилипшие к верхней поверхности монослоя HSEC появляются фазы темно (рис. 6) фаза-яркий то время как те, которые мигрировали через монослой появляются. Клетки затем могут быть классифицированы как имеющие "статическими" адгезии (nonmigrated / раунд), 'изменена форма-' морфология или как "мигрировали" и отдельные категории затем выразили в процентном отношенииОбщая клей населения.

Рисунок 1. Монослоя из первичных человеческих печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток в проточную камеру. A) Microslides наполненные среды, содержащие монослой эндотелиальных клеток до начала потока адгезии анализа. B) Фаза контраст образ сливной монослоя эндотелия, клетки эндотелия следует высевают в предметное стекло, которые были предварительно покрытый (для печеночных клеток эндотелия человека, это должно быть с Тип крысиный хвост коллагена 1), и очень важно, что эндотелиальные клетки здоровы в культуре и сливной. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2. Расход Пробирной палаты. Поток пробирная палата установка можно посмотреть здесь, он состоит из прозрачной камеры, которая установлена ​​на инвертированный микроскоп. Нагреватель помещают в камеру и должны быть термостатом, чтобы поддерживать температуру 37 ° С. Там должно быть портов, доступных для подключения силиконовых трубок из предметное стекло в камере для шприцевого насоса, который расположен снаружи. Предметное стекло помещается непосредственно на столике микроскопа. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3. Шприцевой насос. Шприц насос подключитьред помощью силиконовой трубки в камеру потока. Насос установлен на определенной скорости вывода в зависимости от желаемой напряжения сдвига, необходимого для анализа. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4. Подключение клапан течь камеру.) Электронный электромагнитный клапан позволяет переключаться между двумя шприцов, содержащих либо клетки или носитель практически без мертвого пространства. B) Когда клапан очищается и две бочки установлены, силиконовые трубки с клапана соединен с проточной камеры. Очень важно, чтобы при подключении адаптера на силиконовой трубки к порту на проточной камеры есть жидкость / жидкость. <Нет созданных плейлистов: = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5. Измерение общего лейкоцитов приверженности. Течение последних двух минут после ударной дозы шагом промывочного буфера (как указано в протоколе), минимум десяти случайных полей должны быть зарегистрированы. Они могут быть проанализированы в автономном режиме и общее количество прочно прилипающих клеток можно пересчитать в каждой области. Всего адгезии лейкоцитов можно сравнить между контрольными палатами и те предварительно обрабатывают блокирующие антитела, здесь показано, репрезентативный поле из контрольной скользить и слайд, предварительно обработанного внутриклеточный молекул адгезии-1 (ICAM-1) блокирование антител. Стрелки были добавлены, чтобы выделить прилипшие лейкоциты, в представленииTive поле из управления слайд есть в общей сложности 25 лейкоцитов выявлены и в блок слайд ICAM-1 есть в общей сложности 13 лейкоцитов определены. Масштабные бары = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6. Анализ картины адгезии лейкоцитов на эндотелиальных монослоев по фазовой контрастной микроскопии. Оффлайн анализ записанных полей также может быть использован для изучения направление и скорость адгезии лейкоцитов. Конкретные шаги адгезии каскада могут быть визуализированы и количественно, используя контраст изображений фаз. Фазовые яркие элементы, которые прочно прилипший но не активирован, можно назвать "круглые" прилипание клетки, которые активируютD и фаза ярко можно назвать "форму изменен 'и клетки, которые этап темно являются клетки, которые прошли трансэндотелиальной миграцию и может быть назван" мигрировали ". Изображение показывает примеры каждого шаблона адгезии. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Обсуждение

Наиболее важным шагом для успешного выполнения анализа потока является обеспечение того, здоровый и сливающийся монослой эндотелиальных клеток готова до адгезии поток анализа. Первичные эндотелиальные клетки может быть трудно культуры и чувствительны к изменениям в способов культивирования. Важно, что 1) проточных камерах должным образом и равномерно покрыты эндотелиальных клеток в монослое; для HSEC мы используем крысы I типа коллагена хвоста, но это может отличаться для других эндотелиальных населения, 2) культуральную среду подходит для этого типа клеток, для HSEC мы описали нашу полную среду в разделе протокола. Другие важные шаги включают в себя установки шприцевой насос по соответствующей ставке для отражения физиологические уровни напряжения сдвига.

В ходе анализа потока необходимо предотвращает образование воздушных пузырей внутри контура потока, который может привести к повреждению эндотелия монослой или полосы иммунные клетки с поверхности эндотелиальных. Это может быть предотвращено путем ваннойSuring, что все трубки силикон и адаптеры перфузии промывочным буфером до связи, что все пузырьки воздуха удаляются и что средства массовой информации, предварительно нагретую до использования. При подключении адаптера к портам на предметное стекло очень важно, что есть жидкость / жидкость во время соединения, если есть воздух, то это будет формировать воздушный зазор в системе, которые будут нарушать монослой эндотелиальных течение шприца вывода шаг. Лейкоцитов раствор в цилиндр шприца необходимо регулярно перемешивание, чтобы обеспечить, что клетки не оседают, таким образом поддерживая постоянный плотности клеток в течение всего эксперимента.

Во время шагов записи важно обеспечить образ эндотелия слоя адекватно сосредоточены и ясно, чтобы позволить точную автономный анализ, и что во время второй стадии анализа потока (сообщение лейкоцитов болюсной), что достаточно времени осталось в промывочного буфера фаза перед записью возобновляется для того, чтобывсе неприлипшие лейкоциты удаляются. Аналогичным образом необходимо использовать эндотелиальные клетки в монослое соответствующей плотности, чтобы предотвратить потерю клеток, которые могут препятствовать картины течения в узких капиллярах, а также может быть трудно различить от крупных прикрепленных лейкоцитов в рамках этапа контрастной микроскопии. Мы описали оптимальную плотность посева для печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток человека, но это может варьироваться от различных эндотелиальных популяций и видов.

Значительный прогресс был достигнут в изучении набора лейкоцитов на животных моделях с прижизненной микроскопии. Основное преимущество метода анализа адгезии потока, что набор лейкоцитов могут быть изучены в бинарной системе с первичными эндотелиальных клеток человека. Кроме того, эти взаимодействия могут быть изучены в физиологических соответствующим уровням напряжения сдвига. Важно, чтобы подтвердить выводы прижизненных исследований у животных с сотовых систем человека, так как возможна разностныхэс в эндотелиальных свойств между видами. Одним из ограничений анализа потока является то, что набор лейкоцитов изучается в одноклеточного среды эндотелия монослоя. Кроме того, как только лейкоциты присоединились и переселено через эндотелий они не могут быть в настоящее в достаточном количестве, чтобы быть изолированы и подвергнутых последующих процессов.

Несмотря на эти ограничения, как только адгезия поток анализа было освоено его можно развивать, чтобы выполнить дальнейший анализ адгезии лейкоцитов каскада и адаптированы к резюмировать многоклеточного среды. Длительное запись отдельных полей и использование отслеживания программного обеспечения может быть использован для анализа ползком поведение лейкоцитов. Кроме того после завершения анализа потока в microslides может быть допрошен с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Иммунофлуоресцентной маркировку для изучения адгезии и переселение более подробно. Кроме того, мы уже развиватьсяред модель в пробирке, где течет лейкоциты могли взаимодействовать с печеночной эндотелия обусловлено наличием гепатоцитов. Этот анализ также могут быть разработаны для изучения субпопуляций лейкоцитов: наша группа провел исследования с подмножеств таких как регуляторных Т-клеток, В-клеток и печени проникновения лейкоцитов.

Эти исследования свидетельствуют, что адгезия поток анализ является мощным инструментом для изучения общего и органов конкретный набор лейкоцитов в человеческих систем.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber	Ibidi	80601	Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4	Ibidi	80646
Flow assay chamber	Solent Scientific	33-3322	These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.
Inverted Microscope IX2	Olympus, UK	Model IX50
Harvard Syringe Pump	Harvard Apparatus, UK	702101
Electronic solenoid valve	Lee Products Limited, UK	Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large	Fisher Scientific	FB50855	2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small	Fisher Scientific	FB50853	1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe	Harvard Apparatus, UK	55-0962
Cell separation medium/Lympholyte	VH Bio	CL-5020
Rat Tail Collagen	Sigma Aldrich	C3867-1VL