Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики

Резюме

Белки клеточной поверхности являются биологически важной и широко гликозилированный. Введем здесь подход гликопептид захвата для растворения, обогатить и deglycosylate эти белки для легковесных протеомных анализа на основе ЖХ-МС.

Аннотация

Белки клеточной поверхности, в том числе белков внеклеточного матрикса, участвовать во всех крупных клеточных процессов и функций, таких как рост, дифференцировку и пролиферацию. Комплексный характеристика этих белков обеспечивает богатую информацию для поиска биомаркеров, идентификации камерного типа, и выбор лекарственной целевой, а также помогая продвинуть наше понимание клеточной биологии и физиологии. Поверхностные белки, однако, создают значительные аналитические проблемы, из-за их изначально низкой численности, высокой гидрофобностью и тяжелых пост-трансляционных модификаций. Воспользовавшись тем, что распространенной гликозилирования на поверхностных белков, введем здесь высокой пропускной подход гликопептид захвата, которая объединяет в себе преимущества нескольких существующих N-glycoproteomics средств. Наш метод может обогатить гликопептиды, полученные из поверхностных белков и удалить их гликаны для легковесных протеомики с использованием ЖХ-МС. Разрешенный N-glycoproteome включает инфormation идентичности белка и количества, а также их сайтов гликозилирования. Этот метод был применен к серии исследований в областях, в том числе рака, стволовых клеток и токсичности препаратов. Ограничение метода заключается в низкой численности поверхностных мембранных белков, таких, что относительно большое количество образцов, необходимых для проведения такого анализа по сравнению с исследований сосредоточены на цитозольными белков.

Введение

Белки клеточной поверхности взаимодействуют с внеклеточной среде и передают сигналы с внешней стороны к внутренней части клетки. Таким образом, эти белки, в том числе белков внеклеточного матрикса, играют важную роль во всех аспектах клеточной биологии и физиологии, начиная от распространения, роста миграции, дифференциации к старению и так далее. Поверхностные белки функционируют за счет взаимодействия с другими клетками, белков и малых молекул ^1-3. Молекулярная характеристика белков клеточной поверхности представляет большой интерес не только для биологов, но и для фармацевтических компаний, так как более 60% лекарственных средств направлены на клеточной поверхности белков ^4.

Тандемной масс-спектрометрии (МС), с превосходной чувствительностью, точностью и пропускной способности для идентификации белков и пептидов, был мощным инструментом для глобальных протеомных исследований ^5,6. Тем не менее, поверхностные белки создают значительные проблемы для протеомики MS-основе, каксуществует большинство поверхностные белки в небольших количествах и с тяжелыми изменениями. Мембранные охватывающей регионы поверхностных белков сделать их гидрофобными; это особенно касается многопроходных белков трансмембранных. Таким образом, трудно растворим мембранных белков в водных растворах без помощи моющего средства; Однако использование моющих средств обычно подавляет производительность ВЭЖХ и МС ^1,7,8 в идентификации белков. Таким образом, мембранные белки были слабо отличающийся тем, прямых протеомики на основе LC-MS.

Гликозилирование является одним из наиболее важных и распространенных пост-трансляционных модификаций, происходящих в белков клеточной поверхности ^9. Огромный сложность и неоднородность гликанах препятствовать MS сигнальных пептидов ^'10. Тем не менее, несколько протеомические методы использовали эту уникальную модификацию обогатить поверхностные белки и удалить остатки сахара из белков до ЖХ-МС анализа. Это методс включить лектина на основе сродства захвата ¹¹ и гидразида на основе борной кислоты или на основе химического захвата ^12, а также гидрофильные хроматографии разделения ^8,13. Удаление гликанах превращает мембранные белки с обычными белками и резко упрощает MS характеристику. Потому гликозилирования также происходит в секретируемых белков, которые имеют высокую растворимость в отличие от мембранных белков, многие glycoproteomic методы оптимизированы для растворимых белков, и, как правило, имеют более низкий гликопептидам селективности и чувствительности, когда развертывается с мембранными белками ^8,14. Другие методы также существуют для обогащения, в частности, белков клеточной поверхности, такие как те, которые используют ультрацентрифугирования ¹⁵ и маркировка стратегии ^16. Подробное сравнение между нашего метода и других существующих методов для характеристики мембранных белков проводили в последнее ^17, и результаты показали, что наш метод может функционировать одинаково хорошо, если нелучше, чем все сравниваемых методов мембранные протеомики, но с более высокой простоты.

Чтобы помочь исследователям использовать этот метод, мы здесь подробно общий протокол. Этот метод объединяет несколько преимуществ существующих glycoproteomics стратегий и разработали специально для мембранных гликопротеинов, но метод работает одинаково хорошо для секретируемых белков. Характеристики этого метода включают: 1) полное солюбилизации мембранных белков, 2) обогащение гликопептидов вместо гликопротеинов Для устранения возможности пространственное затруднение при использовании твердого захваченной подложку, 3) использование гидразида химии с образованием ковалентных связей между гликопептиды и захвата подложки, таким образом, что соединенные гликопептиды могут переносить жесткие моет для высокого glycoselectivity и 4) способность проводить всю процедуру захвата в одну трубку для снижения потерь образца и продолжительности укороченной процедуры. После реализации этого метода к изучению с переменнымщества биологических образцов, включая клетки и ткани, мы наблюдали высокую селективность (> 90%), чтобы гликопротеинов ^8,17,18.

протокол

1. Harvest Мембраны

1. Добавить гипотонического буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ KCl, 1,5 _мМ MgCl2, рН 8,0) с коктейль ингибиторов протеаз на клеточного осадка (~ 10 ⁸ клеток) и инкубируют в течение 15-30 мин на льду. Lyse клетки при прохождении пробы через шприцев игл (5-10 проходов) или гомогенизации образца на гомогенизаторе Даунса (15-30 ударов). Используйте гемоцитометра и окрашивания трипановым синим, чтобы проверить эффективность лизиса.
2. Получение микросомальной фракции дифференциальным центрифугированием при 3000 лизата GX 15 мин и затем при 100000 GX 2 час. Первый центрифугирование получает осадок, который ядерная часть, и последующее центрифугирование супернатанта генерирует второй шарик, который микросомальной фракции, которая содержит плазматическую мембрану, а также мембраносвязанных органеллы ^8. Окончательный супернатант цитозольной фракции. Храните микросомальные фракции в -80 ° C морозильник для дальнейших Analysэто, как указано ниже.

2. Растворите, Денатурировать и Дайджест мембранных белков

1. Растворить микросомальной фракции в буфере денатурации (40 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ TCEP, 0,5% Rapigest, рН 8), а затем инкубируют раствор при 100 ° С в течение 10 мин.
2. Охлаждают нагретого раствора до комнатной температуры, добавляют порошок мочевины сверхвысокой чистоты в раствор до 8 м конечной концентрации и инкубировать образец при 37 ° С в течение 30 мин.
3. Добавить иодацетамидом маточного раствора к образцу в 15 мМ конечной концентрации, и инкубируют раствор в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре дл алкилировани свободных тиолов в образце. Добавить DTT маточного раствора к образцу до 10 мМ конечной концентрации и инкубировать решение для еще 10 мин при комнатной температуре, чтобы подавить чрезмерную иодацетамида.
4. Развести полученный раствор 10x с 40 мМ Трис-буфера при рН 8, и затем добавить трипсин к образцу в соотношении 1:20 trypsiн для общего белка. Поддержания реакции переваривания в печи в течение ночи 37 ° C, чтобы обеспечить завершения реакции.
5. Завершить пищеварение путем подкисления раствора образца до рН 1 HCl, состояние, которое также разрушает моющее средство, то есть Rapigest. Ухудшить Rapigest при 37 ° С в течение 1 часа, и удалить разработанный осаждение центрифугированием.
6. Очистите супернатант, содержащий образцы пептидов на С-18 твердофазной экстракции (SPE) картриджа и высушить полученный образец с SpeedVac.
7. Проведение анализа в ДСН-ПААГ образцах до и после трипсин-переваривание, чтобы подтвердить эффективность пищеварения.

3. Гликопептиды Захват

1. Растворить очищенные пептиды в соединительной буфера (100 мМ ацетата натрия, рН 5,5). Добавить периодат натрия в пептидной растворе при 10 мМ конечной концентрации в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Это будет окислять цисдиольными группами в гликанов в альдегиды, Которые позволяют гликаны в пару к смоле через гидразидной химии. Гасят чрезмерного периодат по сульфита натрия в 20 мМ конечной концентрации и рН 5 в течение 10 мин при комнатной температуре.
2. Представьте гидразида-производные смолы в пептидном растворе при соотношении 1:4 (смолы в растворе) в паре гликопептиды со смолой. Выдержите реакцию при 37 ° С в течение 1-2 дней с конца в конец вращения для полного сцепления.
3. Удаления несвязанного пептиды промыванием смолы дважды 1 мл каждого из следующих: DI воды, 1,5 М NaCl, метанол и 80% ацетонитрила. Наконец, промойте смолы 3 раза с 1 мл 100 мМ NH ₄ HCO ₃ при рН 8 для обмена буфер системы до 100 мм NH ₄ HCO _3.
   1. Сбор супернатант и моет для анализа несвязанных пептидов (опционально).
4. Отпустите N-гликопептиды из смолы по PNGase F в инкубации в течение ночи при 37 ° С сн конца в конец вращения. Соберите выпущенные пептиды путем центрифугирования и 80% стирки ацетонитрила. Сушат полученный раствор в SpeedVac для анализа LC-MS.

4. Кроме того фракционирования (необязательно)

Для дальнейшего упрощения сложности образца, фракционирования полученных N-гликопептиды. Например, повторного растворения высушенных пептидов в 10 мМ формиата аммония, рН 3 с помощью 20% ацетонитрила и использовать сильного катионита (SCX) для фракционирования хроматографии пептидов. Сушат полученный элюент, а затем анализируют полученные пептидные фракции с обращенной фазой ЖХ-МС ^8,17,18.

5. Очистка разрешением N-гликопептидами (необязательно)

Если проблемы поднимаются для потенциального загрязнения пептидов, повторного растворения высушенных пептидов в 0,1%-ной муравьиной кислоты и использовать колонку SPE MCX для дальнейшего очистки пептидов до обращенной фазой ЖХ-МС анализ.

Примечание: параметры поиска по базе данных.

Во время избирательной расщепления N-гликопептидами от смолы, PNGase F преобразует N-гликана связанный аспарагин к аспарагиновой кислоты. Таким образом, существует 0,9840 Da сдвиг массы освобожденных N-гликопептидами. Чтобы точно определить эти пептиды, эта модификация должна быть добавлена ​​параметров поиска вместе с общими модификаций, таких как carbamidomethylation цистеина и окисление метионина.

Результаты

Представитель блок-схема экспериментальной процедуры приводится на рисунке 1. Маркировка и дальнейшие шаги фракционирования являются необязательными и детали описаны в недавней публикации ^18. Другой вариант заключается в анализе немодифицированных пептидов, которые н...

Обсуждение

Здесь мы вводим стратегию гликопептид-захвата для профилирования белков клеточной поверхности. Этот метод может быть применен для изучения секретируемые белки, такие как те в крови, а также в других жидкостей организма или в культуральной среде клеток.

Успех метода зав...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755