Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina

Резюме

Сетчатка грызун уже давно признана в качестве доступного окна в мозг. В этом техническом документе мы предоставляем протокол, который использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии для изучения механизмов, которые приводят к выходу из строя сосудистой регенерации в центральной нервной системе после ишемического повреждения. Описанная система также может быть использована для изучения стратегий для продвижения отрастания функциональных кровеносных сосудов в сетчатке и ЦНС.

Аннотация

Сетчатка грызунов, пожалуй, самый доступный система млекопитающих, в которой для расследования сосудисто-нервный взаимодействие в центральной нервной системе (ЦНС). Он все чаще признается, что несколько нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз, присутствующих элементов сосудистой компромисса. Кроме того, самые выдающиеся причины слепоты в педиатрических и работающего населения возрастных (ретинопатии недоношенных и диабетической ретинопатии, соответственно) характеризуются сосудистой дегенерации и разрушения физиологической сосудистой отрастания. Целью данного технического документа заключается в предоставлении подробный протокол для изучения ЦНС регенерацию сосудов в сетчатке. Метод может быть использован для выяснения молекулярные механизмы, которые приводят к выходу из строя роста сосудов после ишемического повреждения. Кроме того, потенциальные терапевтические методы для ускорения и восстановления здоровых сосудистых сплетений могут быть изучены. Выводы obtaineг, используя описанный подход может обеспечить терапевтические возможности для ишемических ретинопатии, такие как, что диабета или недоношенных и, возможно, выиграют других сосудистых расстройств ЦНС.

Введение

На протяжении развития ЦНС, нервов, иммунных клеток и кровеносных сосудов создать удивительно сочетании сетей для обеспечения адекватной перфузии тканей и позволяют передачу сенсорной информации ^1-5. Разбивка сосудистых систем приводит к недостаточной оксигенации тканей и скомпрометированной питания метаболического и получает все большее признание в качестве важного вклад в патогенезе нейродегенеративных заболеваний ^6. Сосудистая отсева и ухудшение сосудисто-нервного блока в мозге, например, связана с сосудистой деменцией, сосудистых поражений белого вещества головного мозга ⁷ и болезни Альцгеймера со стенозом артериол и мелких сосудов ^8. Кроме того, нарушение сосудистой функции барьера, как полагают, способствуют рассеянный склероз ⁹ и боковой амиотрофический склероз ^10.

Непосредственное значение для сетчатки модели, описанной в данном протоколе, ослепляязаболеваний, таких как диабетическая ретинопатия и ¹¹ ретинопатии недоношенных ^{12, 13,} характеризуются фазе ранней сосудистой дегенерации. Последовавшая за этим ишемическая нагрузка на сосудисто-нервного сетчатки вызывает второй этап чрезмерной и патологической неоваскуляризации, что скорее всего возникает как компенсаторная реакция вновь установить кислорода и энергоснабжение ^14-16. Привлекательная стратегия для преодоления ишемический стресс, который занимает центральное место в прогрессирования заболевания является восстановление функциональных сосудистых сетей в частности, в ишемических зон нейро-сетчатки (рис. 2 и 3). Провоцирование контролируемую ангиогенную ответ может встретить, как нелогичным для состояния, в котором антиангиогенные лечения, такие как анти-VEGFs рассматриваются как адаптированных процедур. Тем не менее, доказательства справедливости этого подхода является монтаж. Например, повышение "физиолого-как" сосудистый отрастания в ischemIC ретинопатии было элегантно продемонстрирована путем введения эндотелиальных клеток-предшественников ^17, ингибирование Müller клеток выражали VEGF, индуцированного подавлением других ангиогенных факторов ^18, инъекции миелоидных предшественников, ¹⁹ ингибированию NADPH-оксидазы индуцированного апоптоза ^20, увеличение диетического ω-3 полиненасыщенных жирных кислоты потребление ^21, лечение с карбоксильной-концевого фрагмента триптофана тРНК синтетазы ²² и непосредственным управлением VEGF или FGF-2 для защиты глиальных клеток ^23. Более того, мы показали, что модуляции классические нейронные сигналы наведения, такие как Semaphorins или Netrins в ишемических ретинопатии ускоряет сосудистую регенерацию здоровых сосудов в сетчатке и, следовательно, снижает патологическое развитие кровеносных сосудов ^{24, 25.} Непосредственное клиническое значение, некоторые из вышеупомянутых исследованиях на животных свидетельствуют, что содействие сосудистой репоколение во время ранней стадии ишемической ретинопатии может значительно уменьшить смотровое угрожающих предварительно неоваскуляризации сетчатки ^{19, 23, 24, 26,} скорее всего, за счет сокращения ишемической нагрузки.

Разработка терапевтических стратегий, которые стимулируют регенерацию функциональных сосудов остается сложной задачей для сосудистых биологов. Здесь мы опишем экспериментальную систему, которая использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии (OIR) для изучения стратегий для модуляции сосудистой отрастания в сетчатке. Разработано Смит и др.. В 1994 ^27, эта модель служит в качестве прокси для пролиферативные ретинопатии человека и состоит из не подвергая щенков P7 мыши до 75% О ₂ до Р12, а затем повторного введения щенков до комнатной температуры окружающей O _{2-напряжение} (рис. 1). Эта парадигма свободно имитирует сценарий, где недоношенный ребенок вентилируетсяс O _2. Разоблачение щенков мыши гипероксии провоцирует дегенерацию сетчатки капилляров и микрососудов, и дает воспроизводимый площадь вазо-облитерации (VO), как правило, начисленных на выходе из O ₂ на P12, хотя максимальная площадь В.О. достигается через 48 часов (P9) после воздействие O ₂ ^28. У мышей, ВО зоны бессосудистые спонтанно регенерировать в течение недели, следующей повторного введения в комнатном воздухе и в конечном итоге В.О. зоны полностью заново васкуляризации (рис. 2). Повторное введение в комнатном воздухе мышей, подвергнутых OIR также провоцирует предварительно неоваскуляризации сетчатки (NV) (максимальное в P17), что, как правило, оцениваться с точки зрения эффективности антиангиогенных парадигм лечения. В чистом виде, модель OIR обеспечивает высокую воспроизводимость и количественному инструмент для оценки сосудистой дегенерации кислорода, вызванной и определить степень разрушительного предварительно неоваскуляризации сетчатки ^29-31.

Различные обзорных парадигмы лечения, которые модулируют ЦНС регенерации сосудов могут быть исследованы с помощью OIR модели, включающей использование фармакологических соединений, генной терапии, делеции гена и многое другое. Склонность данного подхода влиять сосудистой отрастания оценивается поэтапный в окне между P12 (максимальная В.О. после выхода из гипероксии) и Р17 (максимальная NV). Оценка результатов лечения патологического по NV может быть быстро и легко определены параллельно и было подробно описано по Stahl и его коллеги ^{30, 31.} Здесь мы предлагаем простой шаг за шагом процедуры для расследования модуляцию физиологической реваскуляризации в нервной сетчатки фармакологическими соединений, перспективных терапевтических, вирусных векторов или для изучения влияния генов-кандидатов в трансгенных или мышей с.

протокол

Заявление Этика: Все эксперименты на животных придерживается руководящих принципов по уходу за животными, установленные Ассоциации для Исследования в зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление для использовании животных в офтальмологической и видение исследований и Канадского совета уходу за животными.

1. Кислород Индуцированные ретинопатия (OIR)

1. Дата закрытия реестра рождения детенышей мыши, как P0.
2. Запишите все массы животных после вступления в O ₂ для обеспечения адекватного диапазон веса. Примечание: C57BL / 6 мышей в P17, масса тела должна быть в пределах от 5 до 7,5 г в течение максимального NV ^32. Для того чтобы сохранить окружающую консистенции, рекомендуется использовать в качестве однопометными управления (для генетически модифицированных мышей, а также у мышей, получавших экспериментальные процедуры). При оценке последствий вирусного вектора, необходимо учитывать тропизм вируса и обеспечить достаточное время для полного выражения вирусно-доставленных трансгенов. Быстро выражая вируснаявекторы, такие как ^3-го поколения лентивирусов ^{24, 25, 33,} рекомендуется.
3. Щенки Место мыши на Р7 (C57BL / 6 или желательно штамм) и CD1, способствующей мать в кислородной камере, установленной на 75% О ₂ в течение 5 дней ^27. Экологическая влажности и температуры на протяжении O ₂ воздействия оставались постоянными. Примечание: Экспериментальные установки, оснащенные центральным источником O ₂ идеально подходят и ограничить громоздкий замену пустой O ₂ танков. При работе с трансгенными или нокаутных мышей, важно, чтобы обеспечить контроль и подопытных мышей получены из того же поставщика, чтобы ограничить генетические дрейф в тех же штаммов ^{30, 29.}
4. В Р12, удалить мышей от кислородной камере и вернуться животных до комнатной O _2.

2. Инъекция для доставки соединений к Внутренней Retina (Втчан оценки воздействия фармакологического соединения или рекомбинантного белка)

1. В P14, обезболить мышей с 2% изофлуран в кислородной 2 л / мин (или защиты животных комитета утвержденных анестетика выбора). Для того чтобы проверить эффективность анестезии, последовательно зажать хвост, заднюю ножку и ухо пинцетом.
2. Наведите мышь на брюхе.
3. С помощью стерильного 10 мкл шприца, снабженного скошенной растянутой стеклянной иглы, выполнять инъекцию максимального объема 1 мкл раствора, содержащего соединение, находящееся под следствием или носитель (физиологический солевой раствор) на заднем лимба глаза, с 45 ° Угол избегая объектив. Примечание: вытащил стекло-игла прикрепляется к шприцу с использованием каплю эпоксидной смолы.
4. Нанесите каплю смазки глазной мази (в идеале с антибиотиком) с тампоном в глаза мыши.
5. Вернуться мышь обратно в клетку с укрепления мать. Мыши не то тщательно контролироваться до повторногопокрыты и полностью амбулаторно.

3. Оценка судов перфузии и барьерной функции (Integrity) на флуоресцентной ангиографии

1. Обезболить мышей с 2% изофлуран в кислородной 2 л / мин (или защиты животных комитета утвержденных анестетика выбора). Для того чтобы проверить эффективность анестезии, последовательно зажать хвост, заднюю ножку и ухо пинцетом. Примечание: Как правило, это осуществляется на P17, когда регенерация оценивается. Также вынос анализ на P19 и P21, чтобы определить, сосудистой целостности сохраняется с течением времени.
2. После того, как под наркозом, весят мышь.
3. Сделайте срединный разрез живота с рассекающих ножницами. Примечание: Режущий инструменты должны регулярно проверяться и заточены.
4. Вырезать ребра с боков и поднять грудную клетку с помощью щипцов. Примечание: Необходимо сократить как с боков, как это возможно, чтобы избежать повреждения сердца.
5. После удаления peripHeral ткани от сердца, зажим нисходящей аорты с гемостаза щипцы.
6. Медленно вводить флуоресцеин-декстрана в левый желудочек с помощью 25 G иглу. Примечание: Если функция сосудистой барьер исследуется, 70 кДа флуоресцеина-декстран применяется, как это будет вытекать из сосудов, когда целостность судна находится под угрозой. Если следователь хочет бросить кровеносные сосуды, 2 МДа флуоресцеина-декстран используется. Критические шаги: 1) обеспечить однородную передел, центрифуги флуоресцеин-декстрана и инъекционные супернатант, 2) в целях предотвращения судно сужение, инъекционные подогретое флуоресцеина-декстран решение, 3) Его время тираж не должен избыток 4 мин.
7. Обезглавьте мышам 2 мин после инъекции с операционными ножницами.

4. Энуклеация и глаз Фиксация

Примечание: При оценке темпов сосудистой регенерации, сначала собрать сетчатки на Р12 и дополнительно на P14 и P17. Увеличение числа отобранных момент временис для более точного определения темпов реваскуляризации ^24.

1. Наклоните голову мыши и разместить его на свою сторону.
2. Удалить кожу и веки, покрывающую глаз, используя рассекает ножницы.
3. Наведите пинцетов под глазом и аккуратно потяните его вверх, пока зрительный нерв разорваны.
4. Поверните голову мыши на другой бок и выполните те же шаги (шаги 4.2 и 4.3).
5. Для обеспечения лучшего проникновения фиксатора, проколоть дырку в передней камере глаза, используя 30 г иглы.
6. Передача глаза в пробирку, содержащую 4% параформальдегида (PFA) и зафиксировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
7. Удалить PFA и мыть глаза 4 раза раствором охлажденного льдом PBS.

5. Сетчатки Рассечение

1. Наведите глаза мыши в чашку Петри, содержащую холодный PBS и выполнять рассечение сетчатки под стереомикроскопом.
2. Удалить лишний жир / ткани, окружающие глаз с микро-рассечение научноssors.
3. Отрежьте роговицы с микро-рассечение ножницами.
4. Использование двух пар щипцов, поминутно очистить склеры от периферии к зрительного нерва и выбросить.
5. Pinch объектив (беловатый шар под роговицы) пинцетом и извлечь его из чашки глаз. Используйте одну пару щипцов в качестве поддержки, а другой для захвата и осторожно поднимите и снимите объектив.
6. Снять гиалоидной сосуды от внутренней стороне сетчатки с помощью небольших щеток (размер 0) и щипцы.
7. Удалить пучки гиалоидной сосудов, соединенных с диска зрительного нерва с помощью щипцов.
8. Передача расчлененный сетчатки до 2 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие PBS и место на льду до начала процедуры окрашивания.

6. Сосудов сетчатки Окрашивание

1. Инкубировать рассеченные сетчатки в течение ночи при осторожном встряхивании при 4 ° С в растворе флуоресцентно-isolectin сочетании B4 (родамин-лектин или другой) в PBS, содержащем 1 мМ CaCl ₂ (1:100 разбавление 2 мг / мл раствора В4 isolectin рекомендуется). Во время всей процедуры окрашивания, покрытия труб с алюминиевой фольгой или непрозрачной пленкой для защиты от света.
2. На следующий день, удалить красящего раствора и мыть сетчатки 3x в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.

7. Подготовка сетчатки Flatmounts

1. Трансфер сетчатки, фоторецепторов стороной вниз, на предметное стекло микроскопа и сделать четыре глубокие равноудаленные радиальные разрезы с помощью хирургического скальпеля разделить сетчатку на четыре одинаковых по размеру квадранта. В разрезов, готовиться сетчатку с помощью кисти так, чтобы он не движется.
2. С помощью двух щеток, пропитанные PBS, тщательно выровнять квадранта фоторецепторов стороной вниз и опустите в сетчатку при монтаже среды для предотвращения фото-отбеливание. Затем осторожно поместить покровное на поверхности смонтированном сетчатки не нажимая и убедившись, что пузырьки воздуха не накапливаются под покровным.

8. Изображений и Количественное Vasoobliteration (VO) и неоваскуляризации (Невада), как описано выше ³¹

1. Возьмите образы целых монтажа сетчатки с эпи-флуоресцентного микроскопа при увеличении в 10 раз.
2. Откройте изображение сетчатки в фото программное обеспечение для редактирования, сшить вместе и измерения общего сетчатки уголок и асептического область. Область может быть выражена в пикселях.
3. Определить степень VO путем деления числа пикселей в лишенной сосудов зоне на количество пикселей в общей области сетчатки.
4. Определить степень NV путем деления количества пикселей NV на количество пикселей в общей области сетчатки, как описано ^31.

Результаты

OIR модель широко используется для изучения кислорода, вызванной дегенерации сосудов и ишемии, вызванной патологическое образование новых сосудов в сетчатке и сыграл важную роль в развитии в настоящее время работают антиангиогенных лечения глазных болезней ^{27, 29, 30.} Выводы, получе...

Обсуждение

Что является наиболее эффективным способом, чтобы стимулировать рост новых здоровых сосудов ишемической нервной ткани? Это терапевтически действует вмешиваться и ускорять естественные сосудистой отрастания? В нейро-ишемическая патологий, таких как ишемических ретинопатии или инсу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945