Экс естественных Культура мышиных эмбриональных Внешний Live-визуализации меланобластов миграции

Резюме

Опишем вскрытие и Экс Vivo культуры мышиных эмбриональных кожи. Система культура содержит воздух-жидкость по всей поверхности ткани и позволяет изображений на инвертированный микроскоп. Меланобластов, составной частью развивающегося кожи, которые помечены флуоресцентно позволяя их поведение, которые должны соблюдаться с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Меланобластов являются нервного гребня получены предшественники меланоцитов; клетки, ответственные за производство пигмента в коже и волосах. Меланобластов мигрируют через эпидермис зародыша, где они впоследствии колонизировать развития волосяных фолликулов ^1,2. Нейронной миграции гребень клетка широко изучены в лабораторных, а в естественных условиях методов по-прежнему не очень хорошо развита, особенно в системах млекопитающих. Одним из вариантов является использование Экс Vivo органотипической культуры ^3-6. Культура мышиных эмбриональных кожи требует поддержания воздушно-жидкостной интерфейса (ALI) по всей поверхности ткани ^3,6. Высокое разрешение проживанию визуализации мышиных эмбриональных кожи был затруднен отсутствием хороший метод, который не только поддерживает этот ALI но и позволяет культура для получения обратной матрицы и поэтому совместим с коротким рабочим расстоянием объективов и наиболее конфокальной микроскопии. В этой статье описываются недавние улучшения в метод, который использует газ мембрану, чтобы преодолеть эти проблемы и позволяет с высоким разрешением конфокальной микроскопии эмбрионального кожи в Экс Vivo культуры ^6. При использовании меланобластов конкретных Cre-рекомбиназы выражающее линию мыши в сочетании с репортером линии R26YFPR мы можем флюоресцентно маркировать население меланобластов в этих культурах кожи. Методика позволяет живой визуализации меланобластов и наблюдение за их поведением и взаимодействием с ткани, в которой они развиваются. Представитель результаты включены для демонстрации возможности жить-изображения 6 культур в параллель.

Введение

Традиционно в зачаточном состоянии кожа была культивировали рассечением из эмбриона мыши и монтажа на поликарбонатной Nuclepore мембраны. Затем мембрану плавали на культуральной среде, тем самым сохраняя воздух-жидкость по всей поверхности ткани развивающегося ^3,4. Этот метод был использован для анализа поведения меланобластов путем фиксации ткани и оценке меланобластов распределение с использованием β-галактозидазы в качестве маркера ^7. Мы разработали метод, который позволяет жить-визуализация флуоресцентно меченных меланобластов в Экс Vivo культуры кожи ^6. Здесь мы опишем метод в деталях от вскрытия, в установке, жить визуализации конфокальной и включают некоторые недавние улучшения.

Меланобласты являются эмбриональными предшественниками меланоцитов клетки, которые продуцируют пигмент в волосы и кожу. Меланобластов возникают в нервного гребня, прилегающей к нервной трубки около эмбриональный день 9 (E9) в развивающихся мыши еmbryo. Впоследствии они мигрируют вдоль дорсолатеральной пути между эктодермой и развивающихся сомитах. В E12.5 они двигаются от дермы в эпидермис, где они размножаются и продолжают их миграции. Первичный волосяной фолликул картина начинает формироваться в эпидермисе на E14.5 и E15.5 меланобластов которые локализации этих фолликулов. Для обзора развития меланоцит / меланоцитов см. Томас & Эриксон (2008) ^1. Для того, чтобы маркировать население меланобластов мы объединили Тир :: CREB животных, которые выражают Cre-рекомбиназу, приводимый в действие мышь промотора тирозиназы ⁸ с R26YFPR животных, которые выражают желтый флуоресцентный белок (YFP) условно с Rosa26 локуса ^9.

Мы опишем метод культуры эмбриональных кожи и захвата изображений с помощью перевернутой конфокальной микроскопии. Она приспособлена форма оригинальный метод описан в Морт и соавт. (2010) ^6. Настоящийметод позволяет изображений в формате 6-луночный и удаляет зависимость от Nuclepore мембран и на Матригель для поддержки культуры. Вместо этого с помощью небольшого блока 1% агарозы, чтобы стабилизировать эмбриональных кожу. Снятие зависимость от матригеле особенно важно в ситуациях, когда реакция эмбриональной кожи к растворимых факторов роста находится в центре внимания исследования. Наш оригинальный метод уже использовался для получения новому взглянуть на развитие меланобластов ^10-13, и мы ожидаем, что улучшения мы описываем здесь сделает его более мощным в качестве экспериментальной методики особенно там, где несколько параллельных культур является обязательным требованием.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все животные работа была выполнена в соответствии с ведомственным руководящим принципам по лицензии Британского МВД (проект номер лицензии PPL 60/3785 и 60/4424).

1. Подготовка

1. Этикетка меланобластов в развивающихся кожи путем объединения соответствующего Cre-рекомбиназы выражающее линию мыши с флуоресцентным репортером мыши линии. Тир :: CREA, Тир :: CREB ⁸ и Wnt1 :: Cre ¹⁴ были успешно использованы в качестве Cre-выражающих линий и R26YFPR ⁹ в качестве репортерной линии.
2. Подготовка питательной среды в ламинаре; дополнить Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с (1% об / об пенициллин / стрептомицин), 10% об / об сыворотки плода теленка и 0,584 г / л L-глутамина.
3. Аппарат жить изображений изложена на рисунке 1 Стерилизовать изображений камеры базу путем протирки с 70% этанола. Стерилизовать вставки, визуализации клипы, и уплотнительные кольца путем замачивания О.В.ernight в 70% этаноле. С помощью стерильной крышкой из 6-луночный планшет в качестве крышке камеры.
4. Нижняя поверхность изображения камеры состоит из увалень мембраны удерживается на месте с помощью уплотнительного кольца (рис. 1). Начните с 35-мм газопроницаемого увалень блюдо. Место блюдо на изображения камеры и вырезать газа мембрану с одной обоюдоострого лезвия бритвы. Нажмите уплотнительное кольцо над мембраной, чтобы закрепить ее на изображения камеры.
5. В визуализации клипы (6 в общей сложности) зажать эмбриональных кожу в месте (рис. 1) перед использованием они должны быть заполнены с 1% агарозы. Подготовьте 2%-ный раствор агарозы стерильной дН ₂ O в микроволновую печь и охлаждения до 60 ° C. Mix 1:01 с 10 мл культуральной среды (см. шаг 2), предварительно нагретую до 60 ° C Стенд клипы визуализации 6 в стерильную чашку 6-а. Накапайте 1% агарозном решение в центре каждого клипа, используя тонкую pastette и дайте ему остыть. Добавить 1 мл холодной стерильной PBS в каждую лунку для предотвращения Agarose от высыхания. Изображающего клипы могут быть сохранены в течение нескольких часов в PBS.
6. Для проведения нежную разделение эмбриональных кожи и обрабатывать расчлененный ткани использовать «метод волосы палку ', как описано в Kashiwagi соавт. ³ Вместо использования палочку бамбука шашлык на шампуре можно использовать. Сделайте небольшой разрез в плоской конце вертеле с помощью одного краями лезвие и вставить мягкую зубную щетку щетиной. Обрежьте вертел так, чтобы она примерно в 15 см в длину.
7. Используйте конфокальной микроскопии с полным климатическую камеру или поставить верхнюю камеру обеспечивает 5% CO ₂ в воздухе. Prewarm столик микроскопа до 37 ° С в течение не менее 1 часа до визуализации. Это помогает предотвратить образец дрейф, вызванный расширением элементов стадии, поскольку они согреться.
8. Подготовьте набор мульти-позиции с помощью программного обеспечения управления микроскопа, чтобы можно было быстро и легко концентрироваться на середине каждой культуры настроить эксперимент.

2. Порядок

1. Mate мышей и назначить первый день после коитуса как день E0.5. В день E14.5, отбирать самку смещением шейных позвонков и выставить в полость тела, сделав небольшой срединный разрез, потянув за исключением кожу в сторону головой и хвостом, а затем резки основной брюшину и пилинг обратно в обе стороны от тела. Проанализируйте матку в холодную стерильной PBS, удерживая твердо пинцетом и отрезая по mesometrium используя хирургические ножницы. Держите матку на льду, пока не потребуется. Для более подробного описания см. Ши и др.. (2007) ^15.
2. Проанализируйте эмбрионов из матки сначала разрезанием длину стенки матки с хирургическими ножницами, чтобы освободить децидуальной а затем рассекает эмбрионов из децидуальной, потянув их на части с двумя парами тонких щипцов. Экран для флуоресцентного репортера выражении (при необходимости).
3. Cull эмбрионов путем обезглавливания перед вскрытием. Подводные лодкиequently удалению хвоста и задних конечностей, а затем передние конечности с помощью одного краями лезвия бритвы. Сохраните ткани для генотипирования, если потребуется.
4. Сделайте надрез в ventrum близко к средней линии в ростро-каудальном направлении. Использование волос палочки, описанной на стадии 1.6, тщательно задразнить далеко кожу от подлежащей соединительной ткани вращающегося эмбрион в то же время. Не снимайте кожу полностью, а оставить его прилагается вдоль брюшной стороны, наиболее удаленном от первого разреза.
5. Важно не допустить, чтобы кожа стала облажался, как это потом очень трудно установить. Чтобы предотвратить это, расплющить кожу с помощью волос палочки (кожная стороной вверх) на поверхности сухой чашке Петри, а затем отрезать от эмбриона ствола с помощью одного краями лезвия бритвы. Кожный сторона можно отличить от эпидермального стороны путем тщательного наблюдения стыке между расчлененный ткани и эмбриона до кожи удаляется. Площадь расчлененного тканипримерно 0,5 мм ² при вскрытии в E14.5 эмбриона.
6. Поместите зажим изображений на верхней части кожи так, что агароза соприкасается с кожной стороной ткани. Дать постоять в течение 60 секунд, а затем тщательно дразнить края ткани до бокам клипа. Переверните клип и использовать волосы торчат выравниваться кожу и удалить пузырьки воздуха, заботясь, чтобы прикасаться к поверхности ткани (в области, которая будет изображена) как можно меньше.
7. С помощью шелковой шовной нити связать кожу к клипу изображения с использованием двух простых большого пальца узлов по обе стороны от клипа изображений так, чтобы они затянуть и тянуть кожу в паз близко к верхней части зажима. Переверните клип, нажмите внутри вставки изображений и место в основе. Заполните вставку с ~ 5 мл культуральной среды (см. шаг 1.2). Рисунок 1 описывает сборку изображения камеры.
8. Повторите протокол для остальных 5 образцов.

3. ЖитьИзображений

1. Камера изображений имеет те же размеры, что и стандартной пластины 6-луночный. Используйте соответствующий пластины вставки смонтировать камеру на сцене конфокальной микроскопии.
2. Автоматизированная этап необходим для образа культуры параллельно. Определите шесть позиций к изображению в конфокальной программного обеспечения. Точные параметры будут зависеть от возможностей используемого микроскопа. Обычно небольшое Z-Stack (3-5 Z-позиции к ответу на любой стадии дрейфа) используется в каждом из 6-положениях и Z-Stack захватывается каждые 2 мин в течение 18-24 часов. Для применений живого изображений как правило, предпочтительно использовать шире, чем оптически оптимальной настройки точечной уменьшить мощность лазера и количество Z-секции требуется.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 2 показывает репрезентативные результаты от времени эксперимента покадровой используя эмбриональных кожу от Тира :: CREB х эмбрионов R26YFPR на E14.5. 6 эмбриональных культурах кожи были обследованы с помощью конфокального микроскопа каждые 2 мин в течение 18 часов. Б?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы опишем метод для культуры эмбриональных кожи, которая особенностью поддаются визуализации жить-клеток на перевернутых конфокальной микроскопии. Способ включает в себя недавние улучшения, которые позволяют 6 культур для включения в образ параллельно и удаляет зависимость от матри?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Biochrom AG	F0475	without phenol red
Penicillin	Sigma	P3032
Streptomycin	Sigma	S9137
Fetal calf serum	Hyclone	SV30160.03
Glutamax	Gibco	35050-038
Ethanol	Generic
Live imaging chamber	Custom made
Lummox dishes	Sarstedt	94.6077.410
6-well plate	Greiner Bio-One	657-160
Single edged razor blade	Fisher Scientific	1244-3170
Agarose	Biogene	300-300
Fine pastette	Generic
PBS	Generic
Kebab skewers	Waitrose		Bamboo BBQ skewers 30 cm
Toothbrush	Generic
Petri dishes	Greiner Bio-One	633185
Suture thread	Look	SP115	Black silk suture thread