Лазерно-индуцированное Разбивка спектроскопия: новый подход по картированию и количественной наночастиц в ткани органа

Резюме

Лазер-пробой спектроскопия выполняется на тонком органа и ткани опухоли успешно обнаружил природные элементы и искусственно вводят гадолиний (GD), выпущенные от наночастиц Б-г на ​​базе. Изображения химических элементов достиг разрешение 100 мкм и количественного чувствительности к югу мм. Совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани.

Аннотация

Излучение спектроскопия лазерной плазмы был применен к элементного анализа биологических образцов. Лазер-пробой спектроскопии (LIBS) выполняется на тонких срезов грызунов тканей: почки и опухолевых, позволяет обнаружение неорганических элементов, таких как (I) Na, Ca, Cu, Mg, P, и Fe, естественным образом присутствуют в организме и (II) Si и Б-г, обнаружен после инъекции наночастиц гадолиния основе. Животные были умерщвлены 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц. Двумерная сканирование образца, выполняется с использованием моторизованного микрометрической 3D-сцену, позволило инфракрасный лазерный луч, чтобы исследовать поверхность с пространственным разрешением менее 100 μ м. Количественный химический изображения элемента Gd внутри органа были получены с чувствительностью к югу мм. LIBS предлагает простой и надежный метод для изучения распределения неорганических материалов без какого-либо специального labeliнг. Кроме того, совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани с различными типами ответ: элементный, молекулярных или клеточных.

Введение

Широкое развитие наночастиц для биологических применений призвал параллельный улучшение аналитических методов для их количественного и обработки изображений в биологических образцах. Обычно обнаружение и отображение наночастиц в органах сделаны флуоресценции или конфокальной микроскопии. К сожалению, эти методы требуют маркировки наночастиц с помощью ближней инфракрасной краски, который может модифицировать биораспределение наночастиц, особенно при очень малых наночастиц из-за его гидрофобных свойств. Обнаружение меченых наночастиц, и особенно очень маленьких наночастиц (размер <10 нм), может, таким образом, препятствовать их биораспределение на всей шкале тела, но и на ткани и клеточных уровней. Разработка новых устройств, способных обнаружить наночастицы без маркировки предлагает новые возможности для изучения их поведения и кинетики. Кроме того, роль микроэлементов, таких как железо и медь в головном мозге болезниг нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера ^1, Menkes ^2,3, или Уилсон ⁴ предложить интерес для изучения и локализовать эти элементы в тканях.

Различные методы были использованы для обеспечения элементарного отображение или микроанализа различных материалов. В их обзоре, опубликованном в 2006 году, Р. Lobinski др.. Представил обзор имеющихся стандартных методов элементного микроанализа в биологической среде, один из самых сложных условиях для аналитических наук ^5. Электронный микрозонд, который состоит из энергии дисперсионного рентгеновского микроанализа в просвечивающем электронном микроскопе, могут быть применены к многочисленных исследований, если концентрация элемент является достаточным (> 100-1000 мкг / г). Для достижения более низких пределов обнаружения, были использованы следующие методы:

• ионного пучка микрозондовый использованием частиц индуцированного рентгеновского излучения μ-PIXE (1-10 мкг / г) ⁶
• синного излучения микроанализ μ-SXRF (0,1-1 мкг / г) ⁷
• вторичная ионная масс-спектрометрия SIMS (0,1 мкг / г) ⁸
• лазерная абляция индуктивно связанной масс-спектрометрии LA-ICP-MS (до 0,01 мкг / г) ^9,10

Вышеупомянутые методы обеспечивают микрометрическое разрешение, как показано в таблице 1, извлеченного из Lobinski соавт.

3D-реконструкция серийных 2D исследований также может быть предложен для реконструкции более глубоких тканей ^11. Тем не менее, все устройства и системы требуют наличия как квалифицированных специалистов, умеренные до очень дорогого оборудования и продолжительный эксперименты (как правило, более чем на 4 ч в течение 100 мкм х 100 мкм для μ-SXRF и 10 мм х 10 мм для LA-ICP-MS ) ^12. В целом, эти требования делают элементный микроанализ очень ограничивающая и несовместимы с обычными системами оптических изображений,флуоресцентной микроскопии или нелинейная микроскопии. Еще один момент, что мы можем упомянуть здесь является то, что количественное возможность измерения по-прежнему довольно ограничен и зависит от наличия соответствующих матрице лабораторных стандартов. Дальнейшее обобщение применение элементарного микроанализа в отрасли процессов, геологии, биологии и других областях применения будет генерировать значительные концептуальные и технологические прорывы.

Целью настоящего рукописи является создание решения для количественного элементного отображения (или элементного микроанализа) в биологических тканей с настольной аппаратуры полностью совместимы с традиционной оптической микроскопии. Наш подход основан на лазерной искровой спектроскопии (LIBS технологии). В LIBS, лазерный импульс сосредоточен на выборке из интереса, чтобы создать разбивку и искру материала. Атомное излучение в плазме затем анализируют с помощью спектрометра и элементарныхконцентрации ментальных могут быть получены с поверочные выполненных заранее ^13,14. Преимущества LIBS включают чувствительность (мкг / г для почти всех элементов), компактность, очень простой пробоподготовки, отсутствие контакта с образцом, мгновенной реакции и точно локализованной (микро) поверхности анализа. Однако, применение химических ткань изображений остается сложной, поскольку лазерной абляции ткани должны быть точно контролироваться, чтобы выполнить карты с высоким пространственным разрешением вместе с чувствительностью в мкг / г диапазоне ^15,16.

При таком решении, присоединением индикаторов или маркировки агентов не требуется, что позволяет обнаруживать неорганические элементы непосредственно в их родной среде в биологических тканях. LIBS инструмент, разработанный в нашей лаборатории предлагает текущее разрешение, ниже 100 мкм по оценкам, чувствительности для Б-га ниже 35 мкг / г, что эквивалентно 0,1 мм ^16, что позволяетотображение больших образцов (> 1 см ²⁾ в течение 30 мин. Кроме того, домашнее программное обеспечение облегчает приобретение и эксплуатацию данных. Этот инструмент используется для обнаружения, карту, и количественно тканевое распределение гадолиния (Gd) на основе наночастиц ^{17 - 18} в почках и образцов опухоли из мелких животных, 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц (размер <5 нм) . Неорганические элементы, которые по своей сути, содержащиеся в биологической ткани, такие как Fe, Ca, Na, и Р, были также обнаружены и в образ.

протокол

1. Биологическая пробоподготовки

Все эксперименты, описанные в данном исследовании были утверждены уходу и использованию животных комитета CECCAPP (Лион, Франция) (авторизация # LYONSUD_2012_004) на, и эксперименты проводились под наблюдением уполномоченных лиц (Л. Sancey, DDPP авторизации # 38 05 32).

1. Добавить 1 мл H ₂ O до 100 мкмоль наночастиц Гадолиний (Б-г) на базе, ждать 15 минут, и добавить 20 мкл HEPES 50 мм, NaCl 1,325 М, CaCl ₂ 20 мм до 100 мкл H ₂ O и 80 мкл первичного решения наночастиц Б-г на ​​базе для получения раствора 200 мкл на 40 мм готовых к Inject (город: Лион, в лаборатории).
2. Введите 200 мкл Б-г на ​​базе решения наночастиц внутривенно в анестезированных опухолями грызунов (Город: Lyon Sud (Уллен), 15 км от лаборатории).
3. 1-24 ч после инъекции, пожертвовать мышейг поставить биологических образцов в изопентана, охлаждаемым жидким азотом. Храните образцы при - 80 ° C (Город: Лион Sud (Уллен), в 15 км от лаборатории).
4. Нарежьте образец (City: обычно Гренобль, в 100 км от лаборатории; я постараюсь, чтобы иметь доступ в Lyon Sud) в 100 мкм толщиной горками и поставить биологические слайды на конкретных пластиковой посуды (чашки Петри). Хранить при температуре -80 ° С.
   Примечание: Пластиковая посуда в основном очень чистый образец полимера. Они используются, чтобы избежать помех элементов, содержащихся в ткани.

2. Подготовка образцов для калибровки

1. Подготовка ампулы с увеличением дозы Gd на основе наночастиц в воду (0 нМ, 100 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ и 5 мМ).
2. Положите 5 мкл-каплю каждого решения регулярно расстоянии 3 мм на чашке Петри.
3. Высушивают при комнатной температуре в течение 20 мин.

3. LIBS Эксперимент

1. Инициализация установки LIBS
   1. Лазерные Настройки. После включения приборов, подождите 10-20 мин для лазерного импульса стабилизации энергии и охлаждения из ICCD камеры до -20 ° С Отрегулируйте энергии импульса с аттенюатора.
      Примечание: Оптимальные параметры лазера для отображения тканях 5 нс длительность импульса, 1064 нм длина волны, энергия импульса около 4 мДж. Лазер использует типичный Nd: YAG лазер наносекунды.
   2. LIBS Настройки. Установка фокусировки лазерного положение (по отношению к поверхности образца), чтобы получить меньший диаметр кратера (около 50 мкм или менее).
      Примечание: Это соответствует лазерного импульса сосредоточения 100 мкм ниже поверхности образца.
   3. Настройки спектрометра. Используйте спектрометр Черни-Тернера в сочетании с 1200 линий / мм решетки и высоким временным разрешением ICCD камеры. Управление всеми этими устройствами с помощью компьютера. Установите значение входной щели до 40 мкм. Установите Спектральный диапазон реГардинг элемент, который будет анализироваться. Используйте спектральный диапазон, охватывающий 325 до 355 нм для обнаружения Б-га с высокой чувствительностью, а также Na, Cu и Ca. Установите параметры ICCD с задержкой 300 нс, ворота 2 мкс, и прироста 200.
2. Отображение измерений
   1. Поместите биологического образца на LIBS моторизованных держателя образца.
   2. Отрегулировать высоту образца в соответствии с положением фокуса лазера.
   3. Возьмите с высоким разрешением фотографию образца среза.
   4. Установите модуль отображения программного обеспечения LIBS приобретения выполнять карту с типично 100 х 100 точек измерения расположенных по решению около 100 мкм.
   5. Запустите приобретение. С этой точки автоматизировать все; последовательность, а также запись спектра перемещения и сохранения. 40 мин требуются для отображения 10000 пунктов (эквивалент 1 см ² для разрешения 100 мкм). Перегруппировка все записанное спектры в тот же файл.
   6. При еinished, взять вторую фотографию образца ломтик
3. Калибровка Измерение

С тех же экспериментальных параметров, измерения калибровочных проб (подробнее подготовки, см. раздел 2). Выполнение карту или записи 25-спектры (полученный из участков измерений в центральной части капли) в каждой из калибровочных капель.

4 Спектральный анализ LIBS:. Построение химического Images

1. Запишите все спектры LIBS из отображения ткани и загружать их в анализе LIBS программного обеспечения. Вычтите базовый для каждого спектра и построить химические изображения с относительной шкале интенсивности использовании ложной цвет.
   Примечание: алгоритм получает конкретные интенсивности линий, таких как Б-га, Cu, Na, Ca или.
2. Выполните те же действия на спектров, измеренных от калиброванного образца, чтобы позволить расчет калибровочных кривых (зависимость между интенсивностью и концентрацией) и построить водныйuantitative карту или изображение для Б-га (или другой элемент интереса).
3. Применить адекватные процедуры для химических изображений, например интерполяции или сглаживания. Сохраните карты интенсивности или концентрации в формате изображения (растрового).

Результаты

Как показано на фиг.1, балки Nd: YAG лазер в фундаментальной длине волны 1064 нм была направлена ​​вертикально вниз на срез ткани кварцевой линзы 50 мм фокусного расстояния. Энергия импульса составляла 4 мДж и частотой повторения 10 Гц. Для того чтобы избежать генерацию плазмы в возду...

Обсуждение

Применительно к биологическим образцом, этот метод позволяет химический изображений, т. е. отображение и количественного, Б-га и Si из введенных наночастиц Б-г на базе в различных органах. Из основных критических настроек, контроль лазерных свойств (длин волн, энергии импульса, фоку?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample