Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

Резюме

Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.

Аннотация

Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности ^1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством ^8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов ^2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP ¹¹⁾ между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) ^12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.

Введение

Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина ^13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов ^2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Во поверхности клетки биотинилирования свободные амины ковалентно модифицированный, с потенциалом, чтобы повлиять на клеточную активность. Исследования, основанные антитела часто мешает поверхностного антигена кластеризации или укупорки, которая может изменить события с торговлей людьми. В связи с этапа отбелки на FRAP сtudies, важной задачей является повреждения основной клеточную структуру. Дополнительным преимуществом является то, что BBS отмеченных конструкции также могут быть использованы для биохимических методик с оборота рецептора в сочетании биотин-Бунгаротоксин ослов. Этот метод легко применим к клеточных линий и первичных клеток. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. Выполнение простой поверхности BGT маркировки (эквивалент Т = 0 момент времени для протокола эндоцитоза) на нетрансфицированных клеток в отсутствие тубокурарина, должны представить доказательства эндогенного Nachr.

Важным фактором для использования этого метода является целесообразным введение в BBS так, что он присутствует на внеклеточный месте, когда представляющий интерес белок доставляется в плазматической мембране. Например, N-концевые домены из GABAAR субъединиц проживают в везикулярного просвета во торговлей людьмиговли и стать внеклеточного рецептора после введения в плазматической мембране, что позволяет конкретной маркировки рецепторами клеточной поверхности и оценка их удаления с поверхности клеток с помощью эндоцитотических событий. Ранее нами было показано, что добавление GFP, Myc, или BBS эпитопов в этой области GABAAR субъединиц функционально молчание. Стандартные элементы должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что меченый белок экспрессируется на том же уровне, чтобы без метки конструкции, что она соответствующим образом локализованы, и что он не влияет на функцию рецептора. Эта характеристика трансфектированных конструкций также поможет в устранении неполадок проблем избыточной экспрессии.

протокол

Все протоколы, описанные ниже, в соответствии с IACUC и IRB этическими комитетами из Университета Питтсбурга в Школе медицины.

1. Подготовка гиппокампа нейронов культур в капот культуры ткани

Примечание: Используйте стерильной техники и реагентов на протяжении протокола 1.

1. Подготовка поли-D-лизина (0,1 мг / мл в H ₂ O) покровные стекла с покрытием в качестве субстрата для нейрональной культуры.
   1. Поместите 4-5 круглые покровные стекла внутри каждого 3,5 см блюдо культуры ткани.
   2. Пятно 70 мкл поли-D-лизина на каждый 12 мм покровным. Примечание: для живого изображения, со стеклянным дном 3,5-см блюдо культуры ткани могут быть использованы (пятно 200 мкл поли-D-лизин на встроенном 14 мм покровным стеклом).
   3. Оставьте приготовленных блюд в капот культуры ткани O / N. Чтобы свести к минимуму поли-D-лизин испарения и держать поверхности стерильные в капот культуры ткани, закрыть створку окна и выключить тыс.э вентилятора O / N. Примечание: УФ лампы не используются во время O / N инкубации.
   4. На следующее утро, мыть посуду 3x 2 мл H ₂ O.
   5. После удаления последнего H ₂ O стирка, добавить 2 мл СМИ к каждому 3,5 см блюдо и не оставляют посуду в инкубаторе до готовности к пластине нейроны в шаге 1.4.
2. Нейронов гиппокампа получают из эмбриональный день 18-19 (E18-19) крыс (модифицированные с Goslin ^22).
3. Трансфекции недавно диссоциированных нейронов в день культивирования с 1-4 мкг maxiprepped конструкцию ДНК.
   Примечание: обычно от 3 ​​мкг ДНК трансфицируют в 1-2 млн. нейронов, с жизнеспособностью 50% и эффективность трансфекции 60% (например, начиная с 2000000 нейронов: ((2 х 10 ⁶ нейронов х 0.5) 0.6) обеспечивает около 1 млн. нейронов;.. 600 000 из которых Трансфицированные ¹ разное количество ДНК-конструкция может быть трансфицированы при устранении потенциальных проблемсверхэкспрессия, а затем соответствующей характеристике конструкта локализации и функции.
4. Пластинчатый трансфицированных нейронов на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизина при конечной плотности приблизительно 200000 нейронов в 3,5 см чашку. Примечание: для стеклянным дном блюдо, тарелка 40,000-50,000 нейронов на 14 мм площадью остекления.
5. Замените носитель 4-24 ч после подготовки нейронов культур, затем позволить нейроны не развивать в инкубаторе до 14-17 дней в пробирке (DIV) или желаемой стадии.

2. Эндоцитоз Анализ

ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на α-бунгаротоксина и тубокурарина отходов и обращению:

1. Обработка всех пептидных нейротоксинов рекомендуется в пределах руководящих принципов уровень биологической безопасности-2 (BL-2) научно-исследовательских протоколов. Все собственно средства индивидуальной защиты необходимо носить. Лиофилизованные токсина порошки должны быть восстановлены в соответствии с инструкциями изготовителя. Токсин отходов шоусть быть утилизированы в соответствии с санитарного состояния окружающей среды и труда руководящего учреждения.
2. Для удаления возможных пептидных агрегатов, которые могли образоваться во время хранения, α-бунгаротоксина аликвоты должны быть кратко центрифугировали перед использованием, и супернатант должен быть использован для эксперимента.
3. α-Бунгаротоксин (Bgt) запасы ресуспендировали до концентрации 1 мг / мл в стерильной _Н2О и хранили в 10 мкл аликвотах при -20 ° С. Флуоресцентно сочетании запасы Bgt используются при 3 мкг / мл. Тубокурарин используют в конечной концентрации 150 мкМ.

1. Установить скамейки верхний нагреватель блока до 16 ° С в холодной комнате с тонкого алюминия или нержавеющей стали пластины на вершине. С другой стороны, если таковые имеются, настольная охлаждение / обогрев устройство может быть использовано для каждого шага, требующего 16 ° C.
2. Прохладный внеклеточного Гепес-солевом буфере (HBS, содержащие в мм: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 глюкозы, 1,2 MgCl ₂ и 2,5CaCl _2, рН 7,4) до 16 ° С на водяной бане.
3. Передача нейронов блюда алюминиевую пластину при 16 ° С и прохладный в течение 5 мин.
4. Удалить вложение (держать обусловленные СМИ и резерв в инкубаторе в течение шагом 2.8, эндоцитоза временных точках анализа) и заменить с 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарина (150 мкм) в течение 2 мин.
5. Удалить HBS + тубокурарин, чтобы обозначенный мусоросборник и заменить 1 мл 16 ° C HBS + тубокурарин (150 мкМ) + α-бунгаротоксина Alexa 594 [3 мкг / мл], инкубации при 16 ° С в течение 15 мин.
6. Удалить HBS + тубокурарин + α-Бунгаротоксин Alexa 594 до обозначенный мусоросборник и мыть посуды 3x 2 мл 16 ° C HBS (промывные воды могут быть собраны с помощью аспирации в вакуумной колбе, содержащей 50 мл 50% хлорной извести).
7. Для экспериментов жить изображений временных рядов следующие рецептора эндоцитоза с помощью стакан дном 3,5 см культуры блюдо, выполните шаги 2.1-2.6, а затем перенести блюдо нагревательный столик(Пельтье устройство) на микроскопе, и начать изображений с конфокальной или установки TIRF микроскопа.
8. Переход T = 0 момент времени покровные в блюдо РТ 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин, продолжая с другими покровные к шагу 2.9.
9. Для других временных точках, заменить HBS с кондиционером, уравновешенную 37 ° C СМИ (защищены в шаге 2.4) и вернуться в инкубаторе в течение эндоцитоза при 37 ° C. Примечание: предложили дополнительные моменты времени Т = 15, 30 и 60.
10. В моменты времени необходимо, принять блюда из инкубатора, мыть быстро дважды 2 мл РТ DPBS (не DPBS не кальций, магний), то исправить в 4% параформальдегида / 4% сахарозы в течение 20 мин.
11. Через 20 мин фиксации, удалить 4% параформальдегида / 4% сахарозы тратить контейнер и мыть посуду в два раза с 2 мл РТ DPBS.
12. Инкубируйте покровные при комнатной температуре в течение 10 мин в растворе иммунофлюоресценции блок (блок решение = 5% лошадиной сыворотки, 0,5% BSA в DPBS), содержащий 0,2% Тритон Х-100 в permeabilИзе нейроны и включить анти-GFP иммуноокрашивания внутриклеточного пула рецепторов и / или маркировки других белков, представляющих интерес.
13. Удалить блок + 0,2% Тритон Х-100 и инкубировать покровные в блоке решения иммунофлюоресценции без Triton X-100 в течение 20-30 мин.
14. Выполните инкубации первичные антитела покровные в блоке в течение нескольких часов при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Примечание: инкубация покровные с праймериз при 4 ° CO / N обычно производит более высокие результаты иммунофлуоресцентных.
15. Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
16. Инкубируйте покровные с вторичными антителами в блоке растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
17. Вымойте покровные 3 раза с DPBS (5 мин для каждого шага стирки).
18. Mount покровные, обработки каждый покровное индивидуально: удаления избытка жидкости из задней части покровного стекла с лабораторной ткани, затем инвертировать покровное на 4 мкл монтажа среду на предметное стекло.
19. Разрешить слайды, чтобы высушить при комнатной температуре покрывается за 30 мин, затем улруда при 4 ° С до готовности для выполнения микроскопии.
20. Сбор и анализ эксперимента с конфокальной микроскопии (слепой экспериментальной состоянии) Изображение. 60X масло Н.А. 1,49 погружения цель со следующими лазеров: аргон 488 нм, 561 диода, 640 диода.
    1. Используя те же настройки захвата изображений, приобрести односпальные Z раздел изображений с нейронной тела клетки и несколько дендритных процессов в фокусе.
    2. Количественно α-бунгаротоксина Alexa флуоресценции GFP сигнал и иммунное окрашивание по 20 мкм 3-4 проксимальных дендритов на один нейрон, используя тот же порог для анализа всех данных эндоцитоза.
    3. Анализ данных из 10-12 нейронов для каждой временной точки, повторяя эксперимент с несколькими независимыми нейрональных культур.

Результаты

Характеристика BBS меткой построить включает в себя важные элементы, такие как определения, если экспрессированный белок собирает надлежащим образом (в частности, с рецепторами, состоящими из нескольких субъединиц), трафика на клеточной поверхности и локализует соответствующим образо...

Обсуждение

В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
P3 Primary Cell 4D kit	Lonza	V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate	Molecular Probes	B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes	B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	B13423
(+)-Tubocurarine chloride	Tocris	2820
Mounting medium	DAKO	cS703
DPBS no calcium, magnesium	Invitrogen	14190-136
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Gephyrin antibody	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT antibody	Synaptic Systems	131 002	1:1,000
anti GFP	Life Technologies	A6455	1:2,000
Glass bottom tissue culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm	Warner Instruments	640-0702