Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Резюме

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Аннотация

Значительный прогресс был достигнут в течение последнего десятилетия к идентификации и характеризации ферментов, участвующих в синтезе (diguanylate циклаз) и деградации (фосфодиэстеразы) второго посланника C-ди-GMP. В отличие от этого, имеется мало информации о молекулярных механизмах и клеточных компонентов, через которые эта сигнализация молекула регулирует широкий спектр клеточных процессов. Большинство известных эффекторных белков относятся к семейству PILZ или выродились diguanylate циклаз или фосфодиэстеразы, которые дали на катализа и приняли эффекторной функции. Таким образом, чтобы лучше определить сотовую сеть с-ди-GMP в широком диапазоне бактерий экспериментальные методы, необходимые для идентификации и проверки новых эффекторы, для которых надежность в предсказания силиконового из строя.

Недавно мы разработали новый Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS) на основе технологии как мощный инструмент длябиохимически выявить и охарактеризовать C-ди-GMP связывающих белков. Этот метод был ранее сообщалось, применимы к широкому кругу организмов ^1. Здесь мы дадим подробное описание протокола, который мы используем, чтобы исследовать такие компоненты сигнализации. В качестве примера, мы используем синегнойная палочка, патогенных микроорганизмов, в которых с-ди-GMP играет важную роль в вирулентности и биопленки контроля. CCMS определены 74% (38/51) из известных или прогнозируемых компонентов сети C-ди-GMP. Это исследование объясняет процедуру СКК в деталях, и устанавливает его в качестве мощного и универсального инструмента для выявления новых компонентов, участвующих в передаче сигналов малой молекулы.

Введение

C-ди-GMP является ключевым вторичным мессенджером, которая используется большинством бактерий, чтобы управлять различными аспектами их рост и поведение. Например, C-ди-GMP регулирует прогрессию клеточного цикла, подвижность и экспрессию экзополисахаридов и поверхностных адгезинов ^2-4. На основе координации этих процессов с ди-GMP способствует формированию биопленки, процесс, который связан с хроническими инфекциями диапазоне патогенных бактерий ^5. C-ди-GMP является синтезированным с помощью ферментов, называемых diguanylate циклаз (РСК), которые укрывают каталитический домен GGDEF ^4. Некоторые РСК обладают ингибирующим сайт, который вниз регулирует циклазным деятельность на C-ди-GMP обязательными. Деградация с-ди-GMP катализируется двумя различными классами фосфодиэстеразы (PDE), несущих либо каталитического EAL или HD-мошенник домен ^6,7.

Большинство из известных эффекторных белков, которые непосредственно связывают с-ди-GMP принадлежат к одной из всего лишь трех классов белков: каталитическиесоюзник неактивные GGDEF или EAL домены и PILZ доменов, небольшие молекулярные переключатели, которые подвергаются конформационные изменения при связывании с-ди-GMP ^8. РСК, уравнений в частных производных и PILZ белки хорошо охарактеризованы, и их доменов может быть предсказана в кремнии сравнительно безопасно. Особый интерес в настоящее время сосредоточена на выявлении новых классов C-ди-GMP эффекторов. Некоторые эффекторы C-ди-GMP с различными связывающими мотивами были описаны недавно такие как CRP / ФНР семейства белков Bcam1349 в Burkholderia cenocepacia или регулятор транскрипции FleQ в P. палочки ^9,10. Кроме того, C-ди-GMP конкретных riboswitches недавно были определены и показаны для контроля экспрессии генов в C-ди-ГМФ-зависимой манере ^11. C-ди-GMP связывающие мотивы различных эффекторов только плохо сохраняется решений биоинформатики предсказания таких белков сложно. Чтобы решить эту проблему, мы разработали биохимический метод, основанный на использовании с-ди-GMP SPEспецифичны Захват соединения в сочетании с масс-спектрометрии ^1,12,13.

Мы недавно инженерии роман трехвалентного C-ди-GMP Захват соединения (CDG-CC, рисунок 1) ^1. Это химическое леса состоит из: 1) часть молекулы C-ди-GMP, используемого в качестве приманки, чтобы захватить с-ди-GMP-связывающие белки, 2) УФ-фотоактивируемый реактивная группа используется для сшивки CDG-CC до границ белков и 3) биотин, чтобы изолировать захваченные белки с использованием покрытых стрептавидином магнитные гранулы. CDG-CC может быть использован непосредственно, а в частности, захват с-ди-эффекторы GMP из сложной смеси макромолекул, как клеточных лизатов. Захват соединения на основе и химические подходы, основанные протеомики, ранее уже сообщалось, применима к широкому кругу организмов, например, Caulobacter crescentus, Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium и П. палочки ^1,14.

В этой методологической работе,мы предоставляем глубокое описание процедуры CCMS с использованием экстрактов P. палочки в качестве примера. Это исследование устанавливает СКК как мощный и универсальный инструмент для биохимически определить новые компоненты, участвующие в передаче сигналов малой молекулы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Lysate Подготовка

1. Растут Р. палочка клеток в LB к желаемой ОД.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для руководства: используйте ≈ 100 мл Культура / образец для фазовых культур стационарных и ≈ 500 мл КУЛЬТУРА / образец для логарифмической фазе культур (OD _{600 нм} = 0,5).
2. Гранул путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г.
3. Ресуспендируйте 0,5-1 г гранул в 1 мл буфера для лизиса (6,7 мМ MES, 6,7 мМ Hepes, 200 мМ NaCl, 6,7 мМ Каца, ДДТ 1 мМ, рН 7,5) и добавить ингибитор протеазы (полный мини, ЭДТА-бесплатно), а также как DNAseI.
4. Лизировать клетки по 3 проходов через французский ячейки давления, в 20000 фунтов на квадратный дюйм (список материалов).
5. Ультра-центрифуги Клеточный лизат при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
6. Сохранить супернатант (перейдите к шагу 2).
7. Вымойте гранул с 1 мл 1x буфера для лизиса с помощью пипетки вверх и вниз.
8. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
9. Вспышка замораживания осадка вжидкий азот и хранить при температуре -20 ° С до использования для захвата мембранных белков (см шаг 3).

2. Удаление свободного С-ди-GMP и другими нуклеотидами (растворимой фракции только)

1. Вымойте колонку PD10 обессоливания (см список материалов) с 10 мл холодного буфера для лизиса.
2. Налейте супернатант (≈ 1 мл) на PD10, чтобы удалить нуклеотидов.
3. Элюируют 4 мл холодного буфера для лизиса (500 мкл) шагов.
4. Выберите наиболее концентрированном фракций, как определено Бредфорда, и объединить их.

3. Пелле Ресуспендирование и Солюбилизация (мембранной фракции только)

1. Ресуспендируют осадок в 500 до 1000 мкл буфера захвата 1x (без моющего средства) (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: гранулы трудно ресуспендирования. Рекомендуется первого пипетки вверх и вниз с помощью пипетки грубо ресуспендируют осадок, затем использовать шприц 27 G хорошо гомогенизации раствора.
2. Добавить 1% (вес / объем) н-додецил-β-D-maltopyranoside (DDM).
3. Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (или O / N) на вращающемся колесе.
4. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
5. Урожай супернатант.

Измерение концентрации 4. Белок

1. Измерение концентрации белка Бредфорда (по BCA анализом для мембранной фракции).
2. Набор общую концентрацию белка 10 мг / мл.

5. Захват

1. Смешайте 300 мкг белка с 1 мМ ВВП, GTP, АТР, СТР, и 20 мкл буфера захвата 5x (100 мМ HEPES, 250 мМ ц, 50 мМ MgAc, 5% глицерина, рН 7,5) (таблица 1). Отрегулируйте объем реакционной 100 мкл Н ₂ О.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем включает объем CDG-CC и С-ди-GMP в случае управления конкуренции (см шаг 5,3 и таблицу 2).
   Примечание: Все эксперименты проводились в 200 и# 181; л 12-труб ПЦР полосы (Thermo Scientific).
   ПРИМЕЧАНИЕ: для мембранной фракции, убедитесь, чтобы всегда держать концентрацию DDM выше критической концентрации мицеллообразования (0,01% вес / объем), пока на стадии белок солюбилизации в 8 М мочевины (этап 7.1).
2. Инкубируйте при 4 ° С в течение 30 мин на вращающемся колесе.
3. Добавить 10 мкм CDG-CC (конечная концентрация).
   ПРИМЕЧАНИЕ: включают в себя управление без CDG-CC (называемый также "контроль бортом"), и дополненных 1 мМ с-ди-GMP ("управления соревнованиями") (см 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация CDG-CC может быть в диапазоне от 1 до 10 мкм.
4. Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (O / N для мембранной фракции) на вращающемся колесе, в темноте.
5. После короткого спина, сшивки путем активации реактивной фрагменту CDG-CC с УФ-светом в течение 4 мин, с использованием CaproBox (см Перечень компонентов, λ = 310 нм, освещенность ≥10 мВт / см², расстояние от источника = 2 см), ПРИМЕЧАНИЕ: снимите крышку полос до сшивания.
6. Добавить 25 мкл 5х буфера для стирки (5 М NaCl, 250 мМ Трис, рН 7,5) и 50 мкл и ресуспендировали стрептавидином магнитные гранулы, осторожно гомогенизируют.
7. Инкубируйте при 4 ° С в течение 1 часа на вращающемся колесе.

6. Стиральные шаги

Примечание: (Магнит: см список материалов). Начните с захвата магнитных шариков в крышке полосы ПЦР, с магнитом. Затем заменить прокладку ПЦР на новую, содержащую следующую промывочного раствора. Удалить магнит и ресуспендируйте бусы, и инкубировать 2 мин. Спин вниз и заменить крышку свежим крышкой.

1. Стиральные стадии (растворимая фракция только)
   1. Вымойте 6 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера.
   2. Вымойте раз в 200 мкл для ВЭЖХ H ₂ O.
   3. Промыть 6 раз в 200 мкл 80% ацетонитрила.
   4. Вымойте 2 раза в 200 мкл для ВЭЖХ H ₂ O.
2. Стиральные стадии (Membraпе доля только)
   1. Вымойте 5 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,1% ДДС.
   2. Вымойте 2 раза в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,05% ДДС.
   3. Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,025% ДДС.
   4. Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,0125% ДДС.
   5. Промыть 3 раза в 200 мкл 100 мМ ABC (бикарбонат аммония, NH ₄ CO ₃₎ + 2 М мочевину.

7. М. Подготовка образцов

1. Ресуспендируют бусины (прямо в крышке) в 20 мкл 100 мМ ABC (100 мм ABC + 8 М мочевину для мембранной фракции) и передать в 1,5 мл пробирки.
2. Только мембранной фракции: инкубировать при 60 ° С в течение 5 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
3. Добавить 0,5 мкл 200 мМ TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфина) и инкубируют при 60 ° С в течение 1 часа, встряхивая при 500 оборотах в минуту. Охладить до 25 ° С.
4. Добавить 0,5 мкл свежеприготовленного 400 мМ иодацетамида и инкубировать при 25 ° С в течение 30 мин, встряхиваят 500 оборотов в минуту и ​​в темноте.
5. Добавить 0,5 мкл 0,5 М N-ацетил-цистеин и инкубировать при 25 ° С в течение 10 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
6. Только мембранной фракции: добавить 1 мкл Lys-C и инкубируют при 37 ° C, O / N.
7. Добавить 2 мкг трипсина и инкубируют O / N при 37 ° С, встряхивая при 500 оборотах в минуту (обертки в парафильмом, чтобы предотвратить высыхание).
   Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.
   Только мембранную фракцию: ПРИМЕЧАНИЕ добавить 100 мМ ABC регулировать концентрацию мочевины <2 м перед добавлением трипсина.
8. Кратко спином вниз трубы и собирать шарики с магнитом.
9. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл (Повторите этот шаг, если шарики остаются).
10. Добавить 5 мкл 5% TFA (трифторуксусной кислоты) + 1 мкл 2 М HCl (15 мкл 5% TFA + 5 мкл 2 М HCl для мембранной фракции).
11. Состояние C18 MicroSpin колонки (гнездо Group, MA, USA) с 150 мкл ацетонитрила (спиновые 20 сек при 2400 оборотах в минуту).
12. Оборlibrate столбцы C18 2 раза 150 мкл 0,1% TFA (спина 20 сек, 2400 оборотов в минуту).
13. Загрузите образец и спин 2 мин, 2000 оборотов в минуту.
14. Обновить проточного на колонку и повторите шаг спиннинг (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
15. Промыть 3 раза с 150 мкл 0,1% TFA, 5% ацетонитрила (20 сек, 2400 оборотов в минуту).
16. Возьмем в новую пробирку и элюируют дважды 150 мкл 0,1% TFA, 50% ацетонитрила (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
17. Высушите пептиды в скорости-VAC.
18. Ресуспендируют в 40 мкл 98% H ₂ O, 2% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты.
19. Ультразвук 20 сек (импульсный цикл 0,5, амплитуда 100%, см список материалов) и спином вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту (настольный центрифуги). Vortex 10 сек, и спин вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту. Трансфер в ВЭЖХ флакон для анализа LC-MS / MS.
20. Замораживание при -20 ° С.
    Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.

8. ЖХ-МС / МС анализ

1. Запуск нано-LC (нано-LC системы) equippред с колонки ВЭЖХ с обращенной фазой (75 мкм х 37 см), заполненную смолой С18 (Magic С18 AQ 3 мкм) с использованием линейного градиента от 95% растворителя А (0,15% муравьиной кислоты, 2% -ным ацетонитрилом) и 5% растворителя В ( 98% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты) до 35% растворителя В течение 60 мин при скорости потока 0,2 мкл / мин.
2. Анализ пептидов с помощью ЖХ-МС / МС (двойное нажатие LTQ-Orbitrap Velos масс-спектрометр, подключенный к источнику ионов электрораспылением).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Режим сбора данных была настроена на получение одного высокого разрешения MS сканирования в FT части масс-спектрометра с разрешением 60000 FWHM последующим MS / MS сканирования в линейном ионной ловушки из 20 наиболее интенсивных ионов. Для повышения эффективности попыток MS / MS, взимается государственная скрининг модус был включен, чтобы исключить отменяется и вместо отдельно взимает ионы. Сговор индуцированной диссоциации срабатывает, когда предшественник превысил 100 ионов на счету. Продолжительность динамического исключения был установлен на 30 сек. Время накопления ионов была установлена ​​на 300 мс (МС) и 50мсек (МС / МС).

9. Поиск в базе данных

1. Скачать P. палочки NCBI-базы данных через домашнюю страницу NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. Преобразование MS сырой спектры в талисман общих файлов (MGF), используя инструмент преобразования MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. Искать в этом MGF файл, используя талисман версии 2.3 против P. палочки NCBI-база данных, содержащая в прямом и обратном-приманки записи белка.
4. Выполните в силикомарганца трипсина пищеварения после лизина и аргинина (если не сопровождается пролина) Мириться два пропущенных расколы в полной мере триптических пептидов.
5. Установите параметры поиска по базе данных, чтобы окисленных метионины (15,99491 DA) как переменную изменениями и carboxyamidomethylation (57,021464 Да) остатков цистеина как фиксированная модификации. Для MASCOT поиск насчисле сканирование с высоким разрешением, положить массу терпимости предшественника 15 страниц в минуту и ​​установите массовой терпимости фрагмент 0,6 Da. Наконец, установите белок FDR до 1%.
6. Импорт талисман поиски P. палочки CCMS опыты в строительные леса (Proteomesoftware, версия 3), установите параметры для получения белка FDR близко к 1%, и извлечь полной спектральной пунктам.
7. По мнению представителя Результаты представлены в этой статье, мы использовали в паре Испытание Т сравнить эксперимент с контролем конкуренции и рассматривается только хиты со значением р ниже 0,1 и спектральной отношение счета над 2 (опыт спектральные отсчеты / управления соревнованиями спектральных на счету).
8. Данные могут быть экспортированы в любой редактор электронных таблиц для дальнейшего анализа.

10. Этикетка без Количественное

1. Импорт необработанных файлов в Progenesis LC-MS программного обеспечения (Нелинейная динамика, версия 4.0).
2. Выполните выравнивание LC-MS и функцию обнаружения по умолчанию в АдминNGS.
3. Экспорт данных в формате MGF от Progenesis LC-MS.
4. Поиск спектров MS / MS, используя талисман против NCBI P. база данных палочка, содержащий вперед и назад, приманки записи белка.
5. Импорт результатов поиска по базе данных в Progenesis ЖХ-МС и карта пептидов идентификации с особенностями MS1.
6. Для оценки данных (расчета уровней значимости, складные изменения коэффициентов) был использован сценарий ProteinSQAnalysis из SafeQuant (порог: значение Q ниже 0,1, спектральный коэффициент счетчика выше 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для идентификации новых C-ди-GMP эффекторов П. палочки мы систематически используется СКК для анализа растворимых и мембранных фракциях P. палочки штамма PAO1 из лог-фазе культуры (OD ₆₀₀ = 0,5). Здесь мы подвести итоги и обсудить репрезентативные результаты этого рыбалку. Были ис...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Особое внимание должно быть принято на несколько шагов протокола. Концентрацию белка является критическим параметром при концентрации 10 мг / мл быть трудно достичь, когда клетки выращивают в определенных условиях роста (например биопленки или небольшие колонии вариантов). Таким ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003