Affinity основе Выделение Tagged ядер от<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Ткани для анализа экспрессии генов

Резюме

Drosophila ткани часто содержат гетерогенную смесь типов клеток. Для изучения экспрессии генов в специфические типы клеток из определенной ткани, ядра могут быть генетически помечены и затем выделяют с использованием подхода сродства основе. Изолированных ядер может быть использован для последующих приложений, таких как анализа экспрессии генов и иммунопреципитации хроматина.

Аннотация

Дрозофилы эмбриональные и личиночные ткани часто содержат весьма гетерогенную смесь типов клеток, которые могут усложнить анализ экспрессии генов в этих тканях. Таким образом, анализ клеточно-специфический профили экспрессии генов из Drosophila тканей, может быть необходимо изолировать специфические типы клеток с высокой чистотой и выходом на достаточном для последующих приложений, таких как транскрипционный профилирования и иммунопреципитации хроматина. Однако неравномерное клеточной морфологии в тканях, таких как центральной нервной системы, в сочетании с редкой популяции специфических типов клеток в этих тканях, может создавать проблемы для традиционных методов выделения клеток, таких как лазерный микродиссекции и флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS) . Здесь, альтернативный подход к характеризующие профили экспрессии генов клеток конкретных используя изоляцию сродства основе меченых ядер, а не целые клетки, описывается. Ядра в конкретной слокоть тип интереса генетически метили ядерной оболочки локализованные EGFP тега с использованием системы двоичного выражения Gal4/UAS. Эти EGFP-меченый ядра могут быть выделены с использованием антител против GFP, которые соединены с магнитными гранулами. Подход, описанный в данном протоколе обеспечивает последовательное выделение ядер от конкретных типов клеток в Drosophila личинок центральной нервной системы при высокой чистотой и при достаточном уровне для анализа экспрессии, даже если эти типы клеток составляют менее 2% от общего количества клеток в ткани. Этот подход может быть использован для выделения ядра из широкого спектра Drosophila эмбриональных и личиночных типах клеток с использованием специфических драйверов GAL4, и может быть полезна для выделения ядра из типов клеток, которые не подходят для FACS или лазерного микродиссекции.

Введение

Drosophila тканей, таких как центральной нервной системы содержат сложную смесь типов клеток. Таким образом, анализ клеточно-специфический профили экспрессии генов из Drosophila тканей, в первую очередь необходимо изолировать гомогенной популяции специфических клеток в количествах, достаточных для последующих применений. Методы, позволяющие изолировать клетки от здоровых тканей включают лазерный микродиссекции и флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) целых клеток. В то время как FACS была использована для выделения клеток и ядер из эмбрионов Drosophila и Caenorhabditis Элеганс от для экспрессии генов и хроматина профилирования ^1-3, FACS и лазерной микродиссекции может быть трудно успешно выполнить в тканях, которые содержат сильно перемешаны типы клеток или содержащие клетки с нерегулярные морфологии, такие как нейроны. Чтобы преодолеть эту трудность, ядра, а не клетки могут быть выделены из специфических типов клеток и использовали для последующего поколенияе выражение профилирования. Важно отметить, что микрочипов на основе анализа экспрессии мРНК с использованием образцов ядерной РНК показывает, как правило, сравнимые результаты с что выполняется с использованием полной РНК ^{4, 5.} Более того, анализ экспрессии генов с использованием ядерной РНК успешно используется для изучения экспрессии генов в различных организмов, включая С. Элеганс, арабидопсис, дрозофилы, и люди ^{4, 5 2, 3.}

Некоторые подходы были недавно описаны для выделения отдельных групп населения меченых ядер из Drosophila тканей, которые подходят для анализа экспрессии генов и / или иммунопреципитации хроматина. Пакетный изоляция тканеспецифической хроматина для метода иммунопреципитации (BITS-Chip) использует FACS изолировать фиксированных ядер на основе камерного типа специфической экспрессии ядерного локализованные GFP ^2. Этот подход был суccessfully используется для анализа распределения модификаций гистонов и транскрипционных факторов с использованием хроматина иммунопреципитацию изолированных ядер из мезодермы эмбрионов Drosophila ^2. Тем не менее, подходы СУИМ основе может быть менее пригодны для выделения меченых ядер, которые составляют лишь небольшую долю смешанной популяции в связи с увеличением времени Упорядочить необходимой для получения подходящих номеров для последующих применений. Чтобы преодолеть эти ограничения, несколько групп использовали методы изоляции сродством на основе очистить ядра, которые помечены с конкретным эпитопом в конкретном типе клеток. Выделение ядер отмеченных в специфические типы клеток методом (неповрежденного судна), разработанных для использования в арабидопсис ^{6, 7} недавно был адаптирован для использования в дрозофилы ^8. В этом методе, слияние ядерная оболочка белок, который является субстратом для в естественных условиях биотинилирования является coexpresСЭД с кишечной палочкой биотин-лигазы Бира в специфические типы клеток. Биотин-меченные ядра может быть очищен от смешанных популяций с использованием стрептавидина на основе сродства изоляцию. Используя этот подход, ядер были успешно промаркированы и изолированы от мезодермы дрозофилы эмбрионов, в которых была выражена слитый белок ядерная оболочка под контролем мезодермы конкретных усилитель ^8. Авторы также генерируется ядерных белков конверт слияния, которые могут быть выражены на любом типе клеток под контролем регуляторной последовательности Gal4, БАС ^9. Этот подход способен быстро выделения подмножества меченых ядер из смешанных популяций, но требует трех отдельных трансгенных конструкции и, следовательно, могут не подходить для определенных генетических приложений. В последнее время подход был описан в котором ВС (S ad1 и ООН С-84) домена, содержащих белки, которые локализуются в внутренней мембране ядерной оболочки были помеченыфлуоресцентные белки и экспрессируется под контролем системы Gal4/UAS ^10. Ядра выдел ют в присутствии неионогенного моющего средства для удаления внешней мембраны ядерной оболочки, и аффинно очищают, использу магнитные шарики, соединенные с анти-GFP антител. Этот подход был успешно использован для выделения небольших популяций меченых ядер от конкретных нейронных подтипов внутри взрослом мозге дрозофилы ^10.

Здесь, протокол для изоляции меченых ядер из смешанной популяции клеток из ткани Drosophila личинок описан. Этот метод был разработан самостоятельно, но похож на подход, описанный Генри и др.. ¹⁰ Во-первых, ядра были помечены флуоресцентным тега, который экспрессируется только в определенных типах клеток в дрозофилы, чтобы облегчить последующую изоляцию отмеченных ядер от смешанным населением используя подход сродства основе. Чтобы пометить ядра,домен KASH (К larsicht / пс-1 / S ин ч omology) был использован. Домен KASH является трансмембранный домен, что локализуется в наружной мембране ядерной оболочки, частично через взаимодействие с ВС домен-содержащих белков внутри перинуклеарном пространстве ^11. С-концевой домен KASH из белков, таких как Drosophila MSP-300 и Klarsicht анкеры эти белки с наружной ядерной мембраны, тогда как их N-концевые домены взаимодействуют с цитоскелета белков, таких как актин или микротрубочек в цитоплазме ^12-14. Конструкции были получены в котором область KASH из Drosophila MSP-300 был присоединен к С-концу EGFP, под контролем регуляторной последовательности UAS Gal4, в векторе pUAST-attB ^{15, 16.} Использование phiC31 сайт-специфической интеграции, были получены трансгенные мухи, в котором UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH трансген был вставлен в attP2 локусов на хромосоме3L ^17. UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH летит могут быть скрещены с мухами, которые экспрессируют драйвер Gal4 в конкретном типе клеток, в результате чего целевой экспрессии EGFP на внешней ядерной мембраны в типе клеток, представляющих интерес. Меченых ядер затем может быть очищен из клеточных популяций смешанных с использованием антитела против GFP, соединенных с магнитными гранулами. В этом подходе, использование неионогенного моющего средства не требуется, поскольку тег EGFP локализуется на цитоплазматической стороне внешней ядерной мембраны и, следовательно, для антител.

Протокол, описанный ниже, могут быть использованы для выделения / обогащения EGFP-меченого ядра из специфических типов клеток у дрозофилы личинок тканей, для количественной оценки чистоты и выхода изолированных ядер и извлечь ядерную РНК подходит для количественного обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (Qrt -PCR) анализ экспрессии генов. Выделение и сродство-очистка ядер (исключая Тканье рассечение) может быть выполнена менее чем за один час. Результаты представлены показывающий, что глиальные ядра могут быть успешно выделены из личиночной оптической доли и глаз имагинального диска, и используется для последующего анализа экспрессии генов. Предполагается, что такой подход будет полезен для выделения / обогащения меченых ядер от эмбриональных и личиночных тканей, в которых клетки-мишени составляют менее 5% от общей численности населения. Все запасы Drosophila и плазмиды, полученные в этом исследовании, можно получить у авторов по запросу.

протокол

1. Генерация и характеристика EGFP :: KASH дрозофилы

1. Водитель Крест Gal4 летит к UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH летит. Кроме того, рекомбинантные мух, которые осуществляют как драйвер Gal4 и трансген UAS-EGFP :: MSP-300 ^Кэш могут быть получены с использованием стандартных методов генной. Этот второй подход выгоден, если требуется большое количество потомства.
2. Охарактеризуйте экспрессию маркера EGFP :: KASH с использованием стандартных методов микроскопии. Примечание: выражение EGFP можно наблюдать с помощью стандартных методов микроскопии в расчлененных, фиксированных Drosophila тканей, или в целом личинок, и не требует применение антитела.
   1. Определить схему экспрессии EGFP :: KASH маркер во всем организме под флуоресцентным микроскопом рассечения (см. материалы PDF). Примечание: многие водители Gal4, включая водителя репо-GAL4, показанной на рисунке 1, выставочная пonspecific паттерны экспрессии в других личинок тканей, таких как слюнной железы (см. результаты).
   2. Анализ паттерн экспрессии EGFP :: Kash в расчлененного интересующей ткани с помощью конфокальной микроскопии.
      1. Закрепить интересующей ткани с использованием формальдегида в конечной концентрации 4%, и пятна ДНК с использованием DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг / мл визуализировать локализацию EGFP :: KASH тег по отношению к ДНК.
      2. Получение изображений с использованием либо 40X / 1,30 иммерсионным объективом или 20X / 0,75 масло иммерсионный объектив, в зависимости от размера интересующей ткани. Следующие условия возбуждения / испускания может быть использован для получения изображения: 408 нм nm/425-475 (DAPI); 488 нм / 525-550 нм (GFP).

2. Изолировать ядер от дрозофилы тканей личинки

1. Подготовка оборудования для личинок вскрытия ткани и последующего ядер изоляции. Обратите внимание, чтоdechorionated целые эмбрионы также могут быть использованы в качестве исходного материала при желании. Рекомендуется использовать частично рассеченные ткани личинок, а не всей личинок, если тип клеток интерес присутствует в конкретной ткани, такой как имагинального диска. Это уменьшает неспецифическое связывание, а также устраняет проблемы, которые могут быть вызваны экспрессии некоторых драйверов Gal4 в нецелевых клеток.
   1. Подготовьте две пары острых щипцов (см. материалы PDF), один силиконизированный стеклянная пластина 9-а (см. материалы PDF) и PBT (1x PBS, рН 7,4, 0,1% Твин-20).
   2. Prebind на GFP антитела к магнитных шариков. Этот шаг должен быть запущен перед началом рассечение. Добавить 10 мкл магнитных шариков (Invitrogen, см. материалы PDF) и 2 мкг GFP антитела (Roche, см. материалы PDF) до 400 мкл промывочного буфера (1x PBS, рН 7,4, 2,5 мМ MgCl ₂₎ в 1,5 мл трубки . Количество шариков и антитело, используемое может быть оптимизирована, если это необходимо в зависимости от количества мишени в СэмаPLE и аффинность связывания антитела с гранулами.
   3. Инкубируйте бусы и антитела при вращении в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
   4. Поместите 1.5 мл пробирку, содержащую бусы и антитела в магнитной стойке (см. материалы в формате PDF) и позволяют шарики для привязки к магнитная примерно 1-2 мин. Удалить супернатант, содержащий несвязанного антитела и мыть с использованием буфера 1 мл пипетки. Шарики останется связан с стенки 1,5 мл трубки на стороне, прилегающей к магниту.
   5. Промыть бусы в два раза 1 мл буфера для промывок каждый раз, как описано в разделе 2.1.4. Снимите 1,5 мл трубку от магнитной стойке и кратко инвертировать смешать шарики и мыть буфер во время каждого шага стирки.
   6. Храните шарики антиген-антитело в промывочного буфера до готовности продолжить с шага 2.7. Шарики не должны высыхать на любой стадии протокола.
2. Проанализируйте тканей личинки в PBT и передать расчлененные тканей дляодна скважина из тарелки 9-а. Как правило, рассечение зрительного доли и глаз имагинального диска от 100 личинок третьей возрастной стадии дает достаточно материала для последующей анализа экспрессии генов следующие ядер изоляции.
3. Промыть выделенную ткань в буфере ядерного экстракции (10 мМ HEPES-KOH, рН 7,5; 2,5 мМ MgCl _2, 10 мМ КСl) в 1,5 мл трубки. Трансфер изолированных тканей личинки к 1 мл Dounce гомогенизатора (см. материалы PDF) на льду, который содержит 1 мл свежего буфера ядерной экстракции. Инкубируют на льду в течение 5 мин. Нет необходимости добавлять ингибиторы протеазы, если РНК должны быть извлечены следующие ядер изоляции.
4. Нарушить ткани на 20 ударов с рыхлой пестиком и затем инкубировать образец на льду в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам расти. Выписка ядра из клеток с использованием 15 ударов с близким пестиком. Количество ударов с свободную и плотно пестики должен быть оптимизирован для различных тканей и типов клеток; избыток гомогенизации может привести кстриженая ядра, в то время как недостаточно гомогенизации не будет извлекать все ядра из ткани.
5. Фильтр гомогената, который содержит ядра и продукты распада клеток, через размером пор сито 40 мкм (см. материалы PDF), который был prerinsed с ядерной буфере для гомогенизации. Сбор отфильтрованной гомогената в свежую пробирку.
6. Соберите образцы предварительно изоляции для последующего анализа для определения ядер выход, целостность ядра, и для определения уровня Стенограмма генов-мишеней ранее к ядрам изоляцию.
   1. Передача 50 мкл отфильтрованной гомогената в свежую 1,5 мл пробирку с помощью пипетки. Это образец предварительно изоляции. Добавить 500 мкл Trizol реагента (см. материалы PDF, ВНИМАНИЕ), инвертировать смешивать, и хранить при температуре -20 ° C для последующего выделения РНК (шаг 3.1).
   2. Передача 20 мкл отфильтрованной гомогената в свежую 1,5 мл пробирку.
      1. Добавить DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг / мл, и вклUbate образец на льду в течение 10 мин.
      2. Трансфер DAPI-окрашенные ядра к покровным покрытием поли-лизин, и поместить на предметное стекло микроскопа. Уплотнение покровное использованием четких лак для ногтей.
      3. Проверьте целостность ядра и наличие GFP с метками ядер, представляющих интерес с помощью флуоресцентного микроскопа. Примечание: Это не обязательно, чтобы исправить ядра, или окрасить для GFP если эти слайды анализируются достаточно быстро следующих подготовки (в пределах 24 ч).
   3. Передача 10 мкл отфильтрованной гомогената в свежую 1,5 мл пробирку и добавить 90 мкл промывочного буфера (1x PBS, рН 7,4, 2,5 мМ MgCl _2). Добавить DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг / мл, и инкубируют на льду в течение 10 мин. Определить доходность ядер в образце предварительно изоляции с помощью гемоцитометра сосчитать DAPI-позитивных ядер с помощью эпифлуоресцентной под воздуха цели 10X.
7. Поместите 1.5 мл пробирку, содержащую бусы антиген-антитело (подготовленные в разделе 2.1.6) в магнитном стойке,и позволяют магнитные шарики для привязки к магниту, по крайней мере 2 мин, как описано в разделе 2.1.4. Извлеките промывочный буфер из шариков антиген-антитело с использованием 1 мл пипетки, а также добавить отфильтрованный гомогената с шагом 2,5 до 1,5 мл пробирку с использованием 1 мл пипетки.
8. Аккуратно инвертировать трубки несколько раз, чтобы смешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин с конца в конец по перемешивании. Избежать пузырьков в трубе, если возможно, так как это может привести к слипания ядер.
9. Поместите 1.5 мл пробирку, содержащую шарики антиген-антитело и гомогената в магнитном стойке, и позволяют магнитные шарики для привязки к магниту, по крайней мере 2 мин, как описано в разделе 2.1.4. Удалить гомогената, содержащего фракцию несвязанного ядер с использованием 1 мл пипетки.
10. Промыть образец 3x с 1 мл промывочного буфера каждый раз. Извлеките 1,5 мл пробирку, содержащую бусы, связанных ядер и промывочный буфер из стойки и инвертировать смешивать несколько раз, а затем поместить трубку в магнитном стойки, как описанона шаге 2.9 и удалить супернатант, используя 1 мл пипетки.
11. Добавить 150 мкл промывочного буфера на шарики, которые должны быть связаны с ядрами мишени. Это образец после изоляции. Подготовка образцов для анализа микроскопии и последующего выделения РНК.
    1. Передача 20 мкл образца после изоляции в чистую пробирку 1,5 мл и пятно с DAPI и анализировать, как описано в разделе 2.6.2. Подсчитайте GFP + / DAPI + и GFP-/DAPI + ядра захваченных магнитных шариков, чтобы определить чистоту обогащенного GFP + ядер в образце после изоляции.
    2. Добавить 1 мл реагента Trizol к остальной части образца после изоляции, инвертировать, чтобы смешивать и хранить при -20 ° С для последующего выделения РНК (шаг 3,1). Примечание: Образцы в триазол могут быть сохранены в течение нескольких недель, при необходимости при -20 ° С Нет необходимости, чтобы элюировать ядра из магнитных шариков до экстракции РНК с использованием тризола реагента, Becausе шарики не мешать последующим выделением РНК.

3. Определить уровни транскриптов в ядрах, выделенных из тканей личинки

1. Изолировать РНК из предварительно изоляции и после изоляции образцов, полученных в разделах 2.6.1 и 2.11.2, используя стандартный протокол, описанный для экстракции РНК Trizol основе (см. материалы PDF) со следующими изменениями:
   1. После осаждения осадок РНК, добавьте 19,2 мкл РНКазы свободной воды и 0,8 мкл реагента RNASecure (см. материалы PDF) к осадку и инкубировать при 60 ° С в течение 20 мин для инактивации РНКазы.
2. Определить концентрацию РНК со связывающим красителя люминесцентная-РНК, такие как комплект Кубит РНК анализа (см. материалы PDF) с помощью QubitR 2,0 флуорометр следуя протоколу производителя.
3. Синтезируют кДНК с использованием усиливающей обратной транскриптазы, такие как EpiScrIPT обратной транскриптазы комплект и oligodT праймеров в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: Как правило, от 50 до 100 нг РНК генерирует достаточное кДНК выполнить выражение множественный ген анализов. Эквивалентные количества предварительного выделения и после выделения РНК должна использоваться для генерации кДНК.
4. Добавить 180 мкл нуклеазы без воды в 20 мкл образца кДНК разбавить этот 10-кратное перед реальном времени анализ количественной ПЦР (КПЦР). Это разбавление является важным шагом, так как неразбавленный образцы кДНК может ингибировать КПЦР.
5. Подготовка КПЦР основной смеси с полимеразы и дНТФ, 4 пмоль каждого из прямого и обратного праймера, состоящий стерильной водой до конечного объема реакции 20 мкл.
   1. Дизайн КПЦР праймеров для генов-мишеней, что, как ожидается, быть выражены в типе клеток, представляющих интерес, так и на стадии развития, на которой ткань собирается. Дизайн праймеров для охватывают интрон, если это возможно, так что геномных иПродукты ПЦР кДНК можно выделить. Примечание: Если профиль экспрессии генов типа клетки-мишени не известно, праймеры против EGFP, который должен быть выражен в частности, в помеченной популяции ядер, могут быть использованы для оптимизации протокола для конкретного типа клеток и тканей (табл. 1).
6. Определите относительные уровни транскриптов каждого гена интереса к предварительно изоляции и после изоляции образцов в сравнении с серии разведений кДНК, полученной из всей ткани. Уровни Стенограмма генов-мишеней должны быть нормализованы с опорным гена, таких как Rpl32 (или предпочтительно несколько опорных генов).

Результаты

Водитель репо-GAL4 (Блумингтон инвентарный номер 7415) специфически экспрессируется в глиальных клеток в Drosophila нервной системы на нескольких этапах развития ^18. Мухи были получены, которые стабильно экспрессируют UAS-EGFP :: MSP-300 ^Кэш под контролем водителя репо-GAL4

Обсуждение

Этот протокол может быть использован для выделения или сильно обогатить специальные коды ядра от населения смешанных клеток в Drosophila эмбриональных или тканей личинки. Используя этот протокол, ядра могут быть выделены из рассеченных тканей в приблизительно 1 часа. Чистота и выход и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L