Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Метод описан для анализа деградацию белков с использованием, меченные радиоактивным изотопом и люциферазы-слитые белки в Xenopus экстракта яичного и его адаптации для высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторов деградации белков.
Xenopus Laevis яйцо экстракт является хорошо характеризуется, надежная система для изучения биохимии различных клеточных процессов. Xenopus яйцо экстракт был использован для изучения белкового обмена во многих клеточных контекстах, в том числе клеточного цикла и путей передачи сигнала 1-3. В данном случае описан способ выделения Xenopus экстракт яйца, который был оптимизирован, стимулирующей деградацию критического компонента Wnt пути, β-катенина. Два описаны различные методы для оценки степени деградации белка β-катенина в Xenopus яичного экстракта. Один метод визуально информативным ([35 S]-меченного радиоактивным изотопом белки), а другой более легко масштабируется для высокой пропускной анализов (люциферазы светлячка-меченый слитых белков). Методики, описанные может быть использован, но не ограничиваются ими, оценивать оборот β-катенина белка и определить молекулярные компоненты, способствующие его оборота. Кроме того, Абилность для очистки больших объемов однородной Xenopus экстракта яичного сочетании с количественной и легкому считывания люциферазы с метками белков позволяет эта система, чтобы быть легко адаптированы для высокопроизводительного скрининга для модуляторов деградации β-катенина.
Xenopus Laevis яйцо экстракт широко используется для изучения многих биологических процессов клеток, включая динамики цитоскелета, ядерной сборки и импорта, апоптоз, убиквитиновой метаболизма, клеточного цикла, передаче сигналов и оборота белка 1-17. Xenopus яйцо система экстракт поддается биохимическом анализе легионом клеточных процессов, потому что экстракт яйцо представляет по существу неразбавленного цитоплазму, содержащую все необходимые цитоплазматические компоненты, необходимые для выполнения этих процессов и позволяют расследование. Большие количества экстракта яичного могут быть получены в свое время для биохимических манипуляций, которые требуют большого количества материала (например, очистки белков или высокопроизводительного скрининга) 18-20. Другим преимуществом является то, что концентрация определенных белков в Xenopus яичного экстракта может быть точно регулировать добавлением рекомбинантного белка и / или immunodepletion из endogтиазом белки в отличие от трансфекции плазмидной ДНК, где экспрессия белка, представляющего интерес трудно контролировать. Кроме того, отсутствие доступных рекомбинантных белков могут быть преодолены путем добавления транскриптов, кодирующих белок, представляющий интерес, пользуясь большой емкости свежеприготовленного Xenopus яйцо сухих веществ перевести экзогенно добавленные мРНК.
Регулирование деградации белка имеет решающее значение для борьбы со многими клеточных путей и обрабатывает 21. Xenopus яйцо экстракт широко используется для изучения деградации белка, так как система позволяет несколько способов мониторинга белкового обмена, не смешивая влияния транскрипции и трансляции. Сигнальный путь Wnt является высоко консервативным сигнальный путь, который играет важнейшую роль в развитии и болезней. Оборот β-катенина, основной эффектор пути Wnt, является объектом жесткого регулирования, и увеличение установившегося состоянии ДEvel из β-катенина имеет решающее значение для активации Wnt генов-мишеней. Важность деградации β-катенина выделен тем, что мутации в пути Wnt, которые ингибируют деградацию β-катенина, найденного в ~ 90% всех спорадических случаев колоректального рака 22. Деградация β-катенин компонентами пути Wnt может быть точно воспроизводятся в Xenopus яйца экстракта изучить механизм его оборота, а также для идентификации новых низкомолекулярные модуляторы его деградации 2, 19, 20, 23-29.
Методы подготовки Xenopus яичного экстракта для изучения клеточного цикла были описаны в предыдущих Юпитера публикаций 30-32. Нынешний протокол описывает модификацию этих методов и оптимизирован для деградации [35 S]-радиоактивно β-катенин и люциферазы с метками β-катенин вXenopus яйцо экстракт. Радиоактивно деградация анализ позволяет для прямой визуализации уровня белка через авторадиографией. [35 S]-метионина включена в интересующего белка с использованием реакции перевода в пробирке, который затем может быть непосредственно добавлен к реакции деградации. Кроме того, анализ радиоактивно оборот белок не требует антитело против белка, представляющего интерес эпитопа или тег, который может влиять на стабильность белка. Потому что даже небольшие изменения в уровнях белков, как это отражено в изменениях в интенсивности с радиоактивной полосы белка, легко визуализируются авторадиографией, [35 S]-радиоактивно деградация анализ представляет собой очень полезный способ визуализации оборота белка 2.
Слияние β-катенина в люциферазы светляков (далее по тексту просто «люциферазы") позволяет точно и легковесных количественных измерений уровней белка, для того,для определения кинетических свойств β-катенина оборота 19, 20. Основным преимуществом люциферазы в том, что он обеспечивает прочную количественную систему, которая легко масштабируется вверх. Следующий протокол предоставляет простые способы анализа деградации β-катенина и устойчивой, эффективной и эффективный способ для высокопроизводительного скрининга новых β-катенина модуляторов.
1. Подготовка Xenopus Egg Extract
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лягушка дает около 1 мл полезной экстракта яиц. Экстракты из 10 лягушки обычно получают за один раз, а объем буфера, описанного ниже, для выполнения 10 лягушки Xenopus экстракт яйцо преп. Объем буфера может быть соответствующим образом скорректированы для больших или меньших препаратов экстракта яиц. Preps, полученные таким образом последовательно дают концентрации белка ≥ 50 мг / мл. Процесс сбора яиц и их переработке в экстракте наиболее эффективен, когда проводится два человека. (Для основных методов лягушка животноводства см. Sive др.. 33).
2. Подготовка экстракт для β-катенина деградации Пробирной
3. Radiolabeled β-катенин деградация анализ в Xenopus яичного экстракта
Примечание: Все шаги должны быть выполнены на льду если не указано иное.
4. Β-катенин-люциферазы Деградация Анализ в Xenopus Egg Extract
Выполните все шаги на льду если не указано иное.
Схема деградации β-катенина в Xenopus яичного экстракта показано на фиг.2А. 35 S-меченого β-катенин инкубировали в Xenopus яичного экстракта аликвоты (1 мл экстракта эквивалент) были удалены в соответствующие моменты времени, и образцы подвергали SDS-PAGE с последующим авто?...
Xenopus яйцо экстракт является надежным биохимическая система для исследования оборот β-катенина. Концентрация β-катенина в Xenopus яичного экстракта составляет ~ 25 нМ 2. При оптимальных условиях, экстракт яйцо способен разлагать β-катенин со скоростью 50-100 нм / ч и составляет п?...
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Мы благодарим Лори Ли за критическое прочтение рукописи. TWC поддерживается в Американской ассоциации сердца Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB поддерживается учебного гранта Национального института рака (T32 CA119925). SSH поддерживается Национальных Институтов Здоровья (R01DK078640). EL поддерживается Национальными Институтами Здоровья (R01GM081635 и R01GM103926).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
ATP | Sigma | A2383-5G | |
Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
16 °C Incubator | Percival Scientific |
A correction was made to Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 µl pelleted beads to 200 µl extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 µl extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 µl of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 µl equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/µl of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 µl of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены