JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Наш отчет описывает уникальный метод для визуализации и анализа взаимодействия КТК / EC в рака простаты в физиологических условиях потока.

Аннотация

Метастазы это процесс, в котором опухолевые клетки пролить от первичной опухоли intravasate сосудистой крови и лимфатической системы, тем самым, получить доступ к вытекать из сосудов в ткань и образованием вторичного нишу. Экстравазации опухолевых клеток из кровеносной системы могут быть изучены с помощью эндотелиальных клеток (ECS) и опухолевых клеток, полученных из различных клеточных линий. Первоначальные исследования проводились с использованием статических условиях, но она была хорошо документирована, что ЭК-разному ведут себя в физиологических условиях потока. Таким образом, различные узлы проточной камеры в настоящее время используется для изучения раковых клеток взаимодействия с ЭК. Текущие сборки камеры поток предложить воспроизводимые результаты, используя как различные клеточные линии или жидкости на различных стрессовых условиях сдвига. Тем не менее, наблюдать и изучать взаимодействия с редких клеток, таких как циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), определенные изменения должны быть внесены в обычной сборке проточной камеры. ЦОКявляются редким клеточной популяции среди миллионов клеток крови. Следовательно, трудно получить чистую популяцию ЦОК. Загрязнение ЦОК с различными типами клеток, обычно находящиеся в обращении неизбежно используя настоящий обогащение или методы истощения. В настоящем докладе мы описываем уникальный метод флуоресцентной метки циркулирующих раковых клеток простаты и изучать их взаимодействие с ЭК в самоорганизующихся системы камеры поток. Этот метод может быть применен в дальнейшем наблюдать взаимодействие между CTCs простаты и любого белка, представляющего интерес.

Введение

Метастазы является сложным многоэтапным процессом, что еще малопонятным. E-selectin/selectin ось лиганд, как было показано, играют важную роль в метастазировании опухолей, способствуя первичных адгезивных взаимодействий между сосудистого эндотелия и раковых клеток 1,2. Эндотелия (Е)-селектина представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый активированными эндотелиальными клетками, в то время как другая Е-селектина лиганд (ы) выражаются опухолевых клеток 3. Подходы Многочисленные в пробирке были успешно использованы для моделирования E-selectin/selectin лиганд взаимодействия между опухолевыми клетками и эндотелиальных клеток (ECS) 1. Для изучения этих взаимодействий, в настоящее время используется различные системы проточной камеры для имитации сосудистую систему крови. Среди камерных собраниях потока, поток камера плоского (PPFC) в сочетании с ЭК обычно используется в качестве модели в пробирке, имитирующей в естественных условиях стресса сдвига. В этомСпособ, ЭК выращивают на 35-мм чашку и после достижения монослой, ЭК прикреплены к PPFC и эксперименты напряжение сдвига на основе выполняются.

Тем не менее, PPFC и другие современные системы представить много ограничений к изучению адгезионные взаимодействия между циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), полученные от пациентов и ECS, в первую очередь, потому, что ЦОК являются редким популяция клеток, сарай от первичной опухоли, циркулирующих среди миллионов клеток крови (1 СТС на 10 9 клеток крови) 4. Таким образом, в отличие от неограниченным запасом культивируемых клеточных линий, низкие показатели CTC привести к очень мало и редкие взаимодействия КТК / ЕС, требующие надлежащего ширину канала поток для записи взаимодействий для анализа воспроизведения. Кроме того, поскольку пациент, полученные ЦОК являются нечистыми населения, поэтому идентификация маркер требуется отслеживать CTCs в конкретных. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новый метод для выявления рака предстательной железы (РПЖ) КТCs, воспользовавшись тем, что практически все эти CTCs выразить простатического специфического антиген мембраны (PSMA) на их клеточной поверхности 5,6. В этом докладе мы использовали простаты линию раковых клеток, MDA PCa2b (MDA), чтобы продемонстрировать потенциальную полезность нашей новой системы для изучения простаты CTC взаимодействия с ЭК, в конце концов, чтобы понять механизм метастазирования.

Наша методология может применяться для различных экспериментов сдвига на основе моделирующих в системе естественных сосудистой 7-9. Кроме изучения взаимодействия РПЖ СТС / ЕС, нынешняя система Проточная камера может быть легко адаптирована для анализа мононуклеарных клеток периферической крови или взаимодействия опухолевых клеток с ЭК. Легкость разборки и сборка проточной камеры, предметное стекло III (0.1) (далее как предметное стекло), позволяет культивирования ECs под перфузии и стимулирования ECs с различными цитокинами, чтобы побудить пр.otein выражение. Кроме того, культурный этике, рекомбинантные белки, такие как E-и P-селектина могут быть покрыты на предметное стекло и взаимодействия с опухолевыми клетками можно наблюдать в условиях ламинарного потока 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культивирование HUVECs на Microslides для наблюдений СТС-эндотелиальных взаимодействий

  1. Под капот культуры ткани, в первую промыть предметное стекло, ширину канала 1 мм с PBS. Осторожно пальто предметное стекло с 200 мкл 50 мкг / мл фибронектина (растворенного в PBS) с использованием 1-мл Luer-Lock шприц.
  2. Накройте предметное стекло с крышкой и держать его внутри капот культуры ткани в течение 30 мин. Медленный дозирование жидкости в предметное стекло предотвращает образование пузырьков в канале.
  3. Заливать 200 мкл теплой (37 ° C) HUVEC ростовой среде (М199 носители, 1М HEPES, 20% FBS, 5 мг / мл гепарина, 100 мкг / мл фактора роста эндотелия клеток и L-глутамина) на предметное стекло и инкубировать 20 мин при комнатной температуре. Во время перфузии, готовить суспензии клеток HUVEC.
  4. Промыть HUVECs с PBS и добавляют 0,05% трипсин-ЭДТА в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Центрифуга HUVECs в 2 мл среды роста при 180 х г в течение 5 мин.
  5. Измерьте концентрацию клеток с использованием neubaUER гемоцитометр и подготовить 10 7 HUVEC клеток/100 мкл ростовой среды. Затем осторожно удалить среды от входа в предметное стекло с помощью пипетки 200-мкл.
  6. Принесите предметное стекло на уровень глаз и с помощью 1-мл Luer-Lock шприц, аккуратно заливать 200 мкл подготовленной концентрации HUVECs в канал. Осторожность необходима на этом этапе, чтобы предотвратить образование пузырьков. Если появляются пузырьки, держать перфузии для немного дольше, пока пузырьки не ввести выпускной канал.
  7. Поместите равный объем (~ 80 мкл) HUVEC массовой информации в обоих входе и выходе на предметное стекло. Это предотвращает приток клеток в любом направлении.
  8. Накройте слайд и держать его в инкубатор (37 ° C) в течение 1,5 часов.

2. Подготовка палаты Ассамблеи Flow для ночных HUVEC культуры на предметное стекло

  1. Наведите стерильный 20 мл шприц, женские и мужские разъемы LUER, труб и шприцевой насос в инкубаторе в течение 15 мин.
  2. Для минимальной мертвого объема, использовать трубку с внутренним диаметром 0,04 дюйма. Меньший диаметр трубы предотвращает образование пузырьков.
  3. Заполните 20-мл шприц с теплой (37 ° C) HUVEC массовой информации (12 мл). Прикрепите трубку с разъемами на шприц. Удалите пузыри. Подключите эту сборку на предметное стекло.
  4. Полностью заполните впуск предметное стекло с HUVEC СМИ. Принесите заполненную 20 мл шприц, прикрепленный к разъему рядом с предметное стекло. Аккуратно приложите разъем к предметное стекло.
  5. Принесите настройку в инкубатор и подключите его к шприцевой насос, установленный в 10 скорости сдвига мкл / мин. Оставьте клетки O / N в инкубаторе при температуре 37 ° С.
  6. На следующий день, разбирать настройку путем удаления соединитель, присоединенный к входному отверстию предметное стекло.
  7. Чтобы активируют E-селектина на ЭК, готовят свежую среду роста, содержащую IL-1β в 10 нг / мл в 4 мл среды. Аспирируйте СМИ в 10-мл шприц. Удалить тон медиафайлы от входе в предметное стекло и подключить шприц к слайду.
  8. Установите шприцевой насос на скорости сдвига 10 мкл / мин в течение 4 ч в инкубаторе.

3. Подготовка Anti-PSMA (J591-488) меченых клеток рака простаты

  1. Во время Ил-1β инкубации HUVECs, подготовить анти-ПСМА J591-Alexa488 помечены РПЖ клетки. Добавить 0,05% трипсин-ЭДТА в MDA клеток в течение 1 мин. Не подвергать клетки к трипсином в течение более длительного времени, как это может влиять на гликопептиды, присутствующих на поверхности клеток. Фермент свободный диссоциации клеток реагент можно также использовать вместо трипсина. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
  2. Ресуспендируют MDA осадок клеток в 1 мл H / H буфера (Хэнкс сбалансированный солевой solution/0.1% HSA/10 мМ HEPES / 1 мМ CaCl 2). Добавить анти-PSMA J591-Alexa488 антитело при 20 мкг / мл в течение 30 мин при комнатной температуре в темном месте. Ресуспендируют клеток при инкубации.
  3. Через 30 мин, центрифугирование клеточной раствора при 800 х г в течение 5 мин. АспиСкорость и ресуспендируют осадок в 1 мл H / H буфера. Подсчет меченых клеток MDA и довести конечную концентрацию до 1х10 6 клеток / мл. Заполните 5-мл шприц с J591-488 меченых клеток MDA и удалить пузырьки.

4. Подготовка Анти-ПСМА (J591-488) Маркированный ЦОК, обогащенном от РПЖ пациентов

  1. Соберите 7,5 мл крови из больных раком простаты в синей кепке трубки (содержащей цитрат натрия). Осторожно развести 1:01 в крови в 0,1% BSA / 1 мМ ЭДТА / ФБР.
  2. Добавить 5,3 мл Ficoll-Paque плюс в 50 мл коническую пробирку. Слой разбавленной крови в верхней части Ficoll-Paque. Центрифуга при 400 мкг в течение 30 мин.
  3. Предварительное покрытие все трубки или наконечники вступления в контакт с ЦОК с 2% FBS/RPMI-1640 / 1 мМ CaCl 2/4 мМ MgCl 2 (R / S буфера) для предотвращения неспецифического связывания из CTCs к поверхностям. Поддерживать 4 ° C температуру СМИ и буферов, которые соприкасаются с ЦОК.
  4. Соберите мононуклеаров периферической крови клетки (МНПК) фракциисодержащий CTCs из интерфейса в другой 50-мл коническую трубку с 30 мл R / S буфер. Центрифуга при 400 мкг в течение 8 мин.
  5. Ресуспендируют гранул и мыть раз в R / S буфера при 400 мкг в течение 8 мин. После центрифугирования ресуспендируют осадок в H / H буфере. Добавить анти-PSMA J591-488 антитело при 20 мкг / мл в течение 30 мин при комнатной температуре в темном месте.
  6. Через 30 мин, центрифуги МНПК содержащие J591-488 меченых CTCs при 800 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют в H / H буфера. Заполните 1-мл шприц (предварительно покрытую R / S буфера) с образцом.

5. Подготовка микроскопа, шприцевой насос и камерной Ассамблея потока

  1. Включите инвертированного микроскопа и установить освещение Kohler на 10X цели. Доведите шприцевой насос на том же уровне, на стадии выборки микроскопа и установить его в 1 дин / см 2 напряжения сдвига (~ 10 мкл / мин).
  2. Откройте программу Zeiss AxioVision. Выберите цель на экране компьютера. Создать новуюпапку в опции инструментов в программном обеспечении.
  3. Откройте опцию умные эксперименты в AxioVision и изменить настройки для записи коротких 30 секунд видео в течение 30 мин.
  4. Для живого флуоресцентного видео, установить опции-12 изображений мс экспозиции, 2 х 2 Bin, 5 Gain. Эти параметры помогут в достижении видео, близкие к частоты кадров (~ 23 кадров в секунду) с камерой Zeiss MRM.
  5. Для визуализации всю ширину канала для потока в 10 X цели на экране компьютера, использовать адаптер C-Mount (0,63 интерфейса xf/60 мм).
  6. Включите ртутной лампы.
  7. Поместите шприц и разъем, содержащий клетки на шприцевого насоса.
  8. Принесите IL-1β стимулировали HUVECs из инкубатора. Подключите разъем к заполненной впускного канала предметное стекло, содержащей HUVECs.
  9. Подключите выходной канал с разъемом, прикрепленной к трубке. Положите трубку в блюдо или 15 мл коническую трубку, чтобы собрать поток через.
  10. Запустите infusiна сквозь предметное стекло при 10 мкл / мин. Соблюдайте взаимодействия между эндотелиальных клеток и меченых клеток MDA или меченых ЦОК, полученных от пациентов в 488 нм фильтра на эпифлуоресцентной микроскопом.
  11. Начало записи эксперимент как 30 сек коротких видеороликов. Во время воспроизведения анализа, измерения скорости качения. Прокатный скорость измеряется путем деления расстояния, пройденного клеток с течением времени.

6. Иммуноокрашивание на предметное стекло

  1. Извлеките носитель из входе и выходе в предметное стекло после перфузии MDA клеток на IL-1β-стимулированных HUVECs в течение 10 мин.
  2. Использование 200-мкл наконечник, положить теплую (37 ° С) PBS, содержащий кальций и магний в входе предметное стекло в течение 5 мин. Наклоните предметное стекло, используя его крышку как опору на скамейке. Держите предметное стекло в наклонном положении для всех инкубации в течение иммунной окраски.
  3. Fix HUVECs путем перфузии теплый 2% формальдегида во входное отверстие
  4. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре. Промыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый.
  5. Добавить Тритон-X 100 (0,1%) в 5% BSA в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Промыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый. Блок с 5% БСА в PBS в течение 30 мин.
  7. Инкубировать с первичным антителом козы против VE-кадгерин (1:100) в 2,5% BSA O / N при 4 ° С.
  8. На следующий день, мыть дважды PBS в течение 5 мин каждый. Добавить вторичный осла анти-козел 647 антитела в течение 45 мин. Мыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый.
  9. Инкубируют при комнатной температуре с гуманизированного J591-Alexa488 конъюгированных антител в течение 1 часа.
  10. Мыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый. Добавить DAPI в течение 5 мин. Промыть дистиллированной воде в течение 5 мин.
  11. Добавить PBS (или Mowiol для долговременного хранения). Визуализируйте предметное стекло под конфокальной микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показан O / N культуру монослоя ЭК на предметное стекло. В окалина на рисунке 1а показывает, что 100% от предметное стекло видна помощью 5X цели в то время как 70% видна с использованием объектива 10X (рис. 1В). Для E-селектина опосредованного взаимодействия,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Из-за малого количества циркулирующих опухолевых клеток среди клеток крови, трудно изолировать CTCs в виде чистого популяции клеток. С целью изучения взаимодействия КТК / EC, редких и нечистое население ЦОК представляет две основные задачи: а) выявление CTCs среди клеток крови; б) Наблюдение...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Доктор Бандер является изобретателем в области патентов, которые назначены Корнельского Research Foundation ("CRF") для J591 антитела, используемого в этой статье. Доктор Бандер является консультантом и владеет акциями в Bzl биопрепаратов, компания в которой патенты были лицензированы CRF для дальнейших исследований и разработок.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансирование из Министерства обороны-простаты программы исследований рака (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 из Национального института рака, и McCooey мочеполовой исследовательского фонда Роберта онкологии. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Annarita Лоренцо (отделение патологии) за предоставление VE-кадгерина, и д-р Марко Seandel (кафедра хирургии) для обеспечения HUVECs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroslideIbidi80331
FibronectinMilliporeFC010
Plastic tubingCole ParmerEW-96115-08
Male Luer adapterGlycoTech31-001
Female Luer adapterGlycoTech31-001
Syringe pumpChemyx IncFusion 100
Luer-lock syringeBD Biosciences309628
M199 mediumSigmaM7653
Endothelial MitogenBiomedical TechnologiesBT-203
HBSSSigmaH9269
Anti-PSMA J591-488Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 betaPeprotech200-01B
TrypsinMilliporeSM-2002-C
HeparinSigmaH-3149
HUVECsWeill Cornell Medical College-Department of Surgeryprovided by Marco Seandel
VE-CadherinSanta Cruzsc-5648
10x objectiveZeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagentMilliporeS-004-C
RPMI-1640Lonza12-702-F
Ficoll-paque plusGE healthcare17-1440-02

Ссылки

  1. Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
  2. Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
  3. Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
  4. Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  5. Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
  6. Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
  7. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
  8. Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
  9. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
  10. Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
  11. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  12. Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
  13. Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
  14. Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
  15. Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
  16. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

87MicroslidesHUVECs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены